论文部分内容阅读
近年来,随着生命科学技术的快速发展,人们发现,在人类的基因组中仅不到3%的转录产物具有蛋白质编码功能,其余大部分均为非编码RNA(ncRNA),其中长的非编码RNA(lncRNA)是一类长度>200 nt的RNA分子,不编码蛋白质,但是它们在转录水平、转录后水平和表观遗传学方面具有重要的功能。MALAT-1(metastasis associated in lung adenocarcinoma transcript 1)最初是在非小细胞肺癌中发现的一个基因间lncRNA;研究发现MALAT-1在各种癌症中与癌细胞的迁移侵袭有关。近年来在斑马鱼中发现了它的直系同源物,但是对于其在斑马鱼发育过程中的作用却知之甚少。本研究旨在确定MALAT-1在斑马鱼胚胎发育过程中的表达和可能的功能。本文首先对MALAT-1进行了生物信息学分析,然后利用qPCR和原位杂交检测MALAT-1在斑马鱼胚胎发育不同时期以及成年不同组织器官中的表达。采用吗啡啉(morpholino)方法在斑马鱼1细胞受精卵敲降MALAT-1,观察MALAT-1功能被干扰/部分抑制后对胚胎发育的影响。利用qPCR方法还检测了MALAT-1敲降后对胚胎发育相关基因和MALAT-1邻近基因表达的影响。所获得的主要实验结果如下:1.生物信息学分析发现,MALAT-1是一个~7.5 Kb的单个外显子转录本,位于斑马鱼14号染色体上,根据lncRNA分类原则属于基因间lncRNA(lincRNA),且仅在3’端具有一定的保守性。2.在斑马鱼胚胎发育各个时期(2、6、10、12、24、36、48、72 hpf),qPCR检测结果显示,除了2 hpf,斑马鱼胚胎各个重要发育时期MALAT-1均有表达;原位杂交结果显示MALAT-1呈现泛表达模式,但主要表达在脑部。3.qPCR检测结果表明,在斑马鱼成鱼所检测的各个组织中,MALAT-1均有不同程度的表达,其中表达强度从高到低依次为脑>眼>心脏>脾>肌肉>肾>肝。4.利用morpholino敲降MALAT-1后,发现斑马鱼胚胎体型变小、心包肿大、眼睛变小,色素沉着减少;另外发现,斑马鱼耳部也有明显的发育缺陷。5.利用morpholino敲降MALAT-1后,检测发育相关基因(egr1、oc90、vsx1、rfng、pax3、neurod4、foxg1、nkx2.5、vmhc和gata4)的表达,结果显示7个基因egr1、rfng、pax3、neurod4、nkx2.5、gata4和vmhc显著或极显著性上调。6.利用morpholino敲降MALAT-1后,检测其邻近基因(macrod1、map1lc3cl、ganab、ubxn1、rarres、romb1、ints5、scyl1、ehd1a和ccdc88b)的表达,结果显示macrod1、map1lc3cl、ganab和ubxn1与对照组相比表达显著性上调;rarres表达虽然未达到显著性但是也呈现上调趋势;romb1和ints5与对照组相比表达则极显著性下调;scyl1、ehd1a和ccdc88b无论在对照组还是MALAT-1敲降组都没有检测到它们的表达。本研究结果表明,MALAT-1主要在斑马鱼神经系统和心脏中高度表达,可能对斑马鱼胚胎脑和心脏的发育具有重要作用。MALAT-1敲降后明显影响发育相关基因及其邻近基因表达,说明它对斑马鱼胚胎发育及其邻近基因的表达具有一定的调节作用。本实验结果不仅为进一步研究MALAT-1在斑马鱼胚胎发育中的作用提供了实验依据,同时对于揭示斑马鱼早期胚胎发育的分子机制及其lncRNAs的生物学功能也具有重要研究价值。