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背景与目的:Survivin基因是近年来发现的凋亡抑制基因,它是凋亡抑制蛋白因子（inhibitor of apoptosis proteins,IAPs）家族的成员之一。Surivin是迄今已鉴定的8个IAPs家族成员（XIAP,HIAP-1,HIAP-2,NAIP,ILP-2,ML-IAP/Livin,apollon,survivin）中分子量（16.5kD）最小和最具有基础与临床意义的基因,因而成为当前肿瘤领域中最为瞩目的一个研究热点之一。Survivin基因具有抑制凋亡、促进细胞增殖和参与细胞周期调控的重要作用,是目前发现的最强的凋亡抑制因子。其抑制凋亡的机制,目前有多种解释:一种为Caspase途径:survivin基因通过与Caspase直接结合或与凋亡前蛋白（second mitochondria-derived activator ofcaspase,SMAC）结合后间接促进IAPs的抗凋亡作用;另一种非Caspase途径:通过与核因子κB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）的相互调控,对促凋亡激酶的抑制或者与丝氨酸/苏氨酸激酶受体的相互作用,抑制凋亡。研究证明:survivin参与了有丝分裂过程,调控微管组织中心（MTOC）,调控有丝分裂纺锤体的形成。在有丝分裂末期,survivin与形成中心体的微管束结合并分布在2个子细胞中心体内,其后便经泛素化蛋白酶体途径迅速降解,显示了它在细胞分裂中的重要功能和地位。此时如果抑制survivin基因表达则会干扰survivin与微管蛋白的结合,使细胞的有丝分裂不能正常进行。对细胞周期的调控,其机制是通过其苏氨酸的a螺旋结构与有丝分裂纺锤体连接,特异性地表达于G2/M期,成为细胞周期G2/M期检测点的调控基因。Survivin的过量表达可以帮助肿瘤细胞逃避细胞周期检测点,使肿瘤细胞逃避凋亡,实现异常增殖。抑制凋亡、促进细胞增殖和参与细胞周期调控这三种重要的功能密切相关,共同作用于细胞,参与肿瘤的发生和发展。大多数研究表明survivin只表达于肿瘤组织,而在正常组织中不表达,虽有少数学者认为survivin也可表达于正常组织,但这些研究也表明其在正常组织的表达强度显著低于其在肿瘤组织的表达强度,这一独特的特性,使survivin当仁不让的成为新的肿瘤研究和治疗的靶点。RNA干扰是用与目的基因mRNA相同序列的21-23nt双链小分子干扰RNA来特异性高效率的抑制目的基因蛋白的表达。有研究表明,带有shRNA（小发夹RNA）表达框架的载体可以取得较高的RNA干扰效应,已有不少学者应用survivin特异的shRNA或siRNA对多种肿瘤进行了干预治疗,取得了显著的效果,但对喉肿瘤的治疗国内外尚未见报道。本实验的目的:1.对60例喉鳞癌病理切片和10例正常喉部粘膜进行免疫组织化学检测,观察survivin在喉鳞癌组织和正常喉部粘膜的表达情况;2.构建表达shRNA质粒载体,通过转染细胞（喉癌细胞株）进行体外RNA干扰实验,观察其对喉癌细胞中survivin基因的抑制效果,以及抑制喉癌细胞的生长和诱导细胞凋亡的作用。方法:1.采用免疫组织化学技术检测survivin基因在60例喉鳞状细胞癌标本、10例正常喉粘膜中的表达。2.选取了survivin基因（NM001168）序列中的三个位点序列作为siRNA的正义链,正义链和反义链之间加入9个寡核苷酸（TTCAAGACG）形成发夹结构,以TTTTTT作为终止信号,5′-端为BamHⅠ酶切位点末端,3′-端为HindⅢ酶切位点末端,合成寡核苷酸序列克隆到载体上,构建三个靶向survivin的质粒载体分别命名为survivin-shRNA-1,survivin-shRNA-2,survivin-shRNA-3,通过序列测定鉴定重组子的正确性。3.将三个重组survivin-shRNA质粒转染细胞,48小时后收集细胞进行检测,运用反转录PCR检测在mRNA水平survivin-shRNA质粒对survivin基因的沉默效果;运用Western Blot检测在蛋白水平survivin-shRNA质粒对survivin基因的沉默效果;连续观察五天喉癌细胞的生长状况,构建生长曲线,观察对喉癌细胞的生长抑制作用;应用PI单染流式细胞仪检测细胞周期,观察干扰质粒对细胞周期的影响;应用流式细胞仪通过Annexin V-FITC/PI双染检测细胞的早期凋亡,PI单染检测细胞的晚期凋亡,观察干扰质粒对喉鳞癌细胞的凋亡诱导作用。结果:1.Survivin蛋白在10例正常喉粘膜中均无表达,60例喉鳞癌标本中有41例阳性,阳性表达率为68.33%;其中男性56例,阳性例数为40例,阳性表达率为71.43%,女性4例,阳性例数为1例,阳性表达率为25%;60岁以上者32例,阳性例数为22例,阳性表达率为68.75%,60岁以下者（包括60岁）28例,阳性例数为19例,阳性表达率为67.8 6%;声门上型18例,阳性例数为13例,阳性表达率为72.22%,声门型42例中28例阳性,阳性表达率为66.67%;按照国际抗癌协会（UICC）TNM分类标准（1992）第四版第二次修订的方案,临床分期:Ⅰ-Ⅱ期31例,阳性例数为17例,阳性表达率54.84%,Ⅲ-Ⅳ期29例,阳性例数24例,阳性表达率82.76%;病理分级:高分化鳞状细胞癌28例,阳性例数为20例,阳性表达率为71.43%,中分化鳞状细胞癌19例,阳性例数为12例,阳性表达率为63.16%,低分化鳞状细胞癌13例,阳性例数为9例,阳性表达率为69.23%;病理证实颈淋巴结转移15例,阳性例数为14例,阳性表达率为93.33%,无颈部淋巴结转移45例,阳性例数为27例,阳性表达率为60%。经统计学分析,喉癌组survivin蛋白的表达率明显高于正常对照组（p<0.001）,survivin蛋白表达与喉鳞癌患者临床分期、颈部淋巴结转移有关,差异有显著性（P<0.05）,颈淋巴结阳性者survivin蛋白阳性表达率高于颈淋巴结阴性者;Ⅲ-Ⅳ期的患者survivin蛋白阳性表达率高于Ⅰ-Ⅱ期的患者;survivin蛋白阳性表达在不同性别组的差异无显著性（P=0.056）;survivin蛋白阳性表达在不同年龄组的差异无显著性（P=0.941）;survivin蛋白阳性表达在不同发生部位的差异无显著性（P=0.674）;survivin蛋白阳性表达在不同病理分级组的差异无显著性（P=0.836）。2.酶切鉴定和DNA序列测定结果证实三个重组质粒载体survivin-shRNA构建正确,插入序列位置正确。3.重组质粒survivin-shRNA转染细胞后,RT-PCR结果显示三个survivin-shRNA质粒均使survivin基因在mRNA水平受到了显著的抑制,分别下降了65.77±0.82%,56.66±0.70%,63.26±1.0%,与转染阴性对照质粒组相比具有显著性差异,三者之间相比survivin-shRNA-1和survivin-shRNA-3无显著性差异,survivin-shRNA-2抑制率低于前两者,而转染阴性对照质粒组的mRNA量与未处理组相仿,无明显下调;Western-blot结果显示三个survivin-shRNA质粒均使survivin基因在蛋白水平受到了显著的抑制,分别下降了61.50±0.79%,52.91±1.43%,59.36±0.53%,与转染阴性对照质粒组相比具有显著性差异,三者之间相比survivin-shRNA-1和survivin-shRNA-3无显著性差异,survivin-shRNA-2抑制率低于前两者,而转染阴性对照质粒组的蛋白表达量与未处理组相仿,无明显下调;生长曲线结果显示三个survivin-shRNA质粒均使喉癌细胞株生长受到显著抑制,在转染后72小时抑制效果达到最高,与转染阴性对照质粒组相比具有显著性差异,三者之间相比,survivin-shRNA-1和survivin-shRNA-3抑制率相仿,且自72小时后survivin-shRNA-2组的细胞数与其他两组有显著性差异,说明survivin-shRNA-2的抑制效果较survivin-shRNA-1,3为弱。PI单染流式细胞仪检测细胞周期结果显示转染干扰质粒细胞组出现明显G2/M期的阻滞,并且出现明显的亚G1峰,标示细胞晚期凋亡,凋亡百分率分别为15.32±1.969%,8.58±0.949%,14.85±1.786%,与转染阴性对照质粒组相比具有显著性差异,三者之间相比survivin-shRNA-1和survivin-shRNA-3无显著性差异,survivin-shRNA-2凋亡率低于前两者,而转染阴性对照质粒组未出现G2/M期的阻滞现象,并且凋亡率（3.22±1.06%）与未处理组（1.36±0.243%）无明显差别;Annexin V-FITC/PI双染检测细胞早期凋亡,显示凋亡率分别为13.63±1.940%,8.61±1.400%,12.71±2.141%,与转染阴性对照质粒组相比具有显著性差异,三者之间相比survivin-shRNA-1和survivin-shRNA-3无显著性差异,survivin-shRNA-2凋亡率低于前两者,而转染阴性对照质粒组的早期凋亡率为2.58±0.632%,与未处理组相比（早期凋亡率为2.43±0.663%）无明显差别。结论及意义:重组survivin-shRNA质粒可以下调喉癌细胞株中survivin基因的表达,降低细胞增殖活性,使细胞周期停滞及凋亡增加,从而抑制肿瘤细胞的生长,为肿瘤生物基因治疗方面的研究提供了新的思路,该技术有望成为喉癌及其它survivin高表达肿瘤治疗中有效的辅助治疗方法。