【研究背景及目的】肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的恶性肿瘤之一,我国是肝癌高发区。肝癌起病隐匿、恶性程度高、侵袭转移快,其治疗仍是世界性难题,临床迫切需要寻找新的治疗方法。恶性肿瘤的诱导分化治疗(differentiation therapy)是近20年来肿瘤治疗的重大突破。诱导分化治疗是通过诱导分化方法促进肿瘤细胞向成熟阶段分化、恢复其正常表型和功能,并抑制恶性肿瘤细胞的增殖。本课题组前期研究发现,肝细胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4α,HNF4α)在正常肝细胞中高表达,而在多种肝癌细胞株中表达明显下降。利用HNF4α重组腺病毒表达载体(AdHNF4α)导入肝癌细胞株中,上调HNF4α表达,结果发现HNF4α可诱导肝癌细胞向肝细胞转化,大量肝细胞特异基因表达明显提高,并可显著抑制肿瘤细胞增殖,使肝癌细胞裸鼠体内成瘤性完全丧失,裸鼠皮下种植瘤内注射AdHNF4α可明显抑制肿瘤生长,表明HNF4α有可能成为治疗肝细胞癌的有效药物。为进一步探索HNF4α对肝癌细胞诱导分化的机制,我们以基因芯片技术筛选HNF4α作用于肝癌细胞株Hep3B细胞后的差异基因,在肝癌细胞株Hep3B细胞及肝母细胞瘤株HepG2细胞上验证差异基因,并分析HNF4α诱导肝癌细胞分化的可能机制。实验包括三个部分:1. HNF4α对肝癌细胞基因表达谱的影响;2. HNF4α对肝癌细胞上皮细胞间质转型(epithelial to mesenchymal transition,EMT)的影响;3. HNF4α对肝癌细胞Wnt/β-Catenin信号转导通路的作用。【实验方法】一、HNF4α对Hep 3B细胞基因表达谱的影响人肝癌细胞株Hep3B以5×10~5/皿接种于35 mm培养皿,细胞贴壁后将重组复制缺陷型腺病毒AdHNF4α及对照病毒AdGFP以感染复数(multiplicity of infection, MOI)100感染细胞,分别于感染病毒后48小时及72小时收集细胞,抽提总RNA,制备cDNA探针,采用美国Affymetrix公司人类全基因组表达谱芯片(Affymetrix U133plus 2.0 Array)进行杂交,获取2组差异表达基因谱,以Affymetrix GineChip Scanner 3000扫描仪进行荧光信号扫描,GeneChip Operating Software (GCOS软件)读取和处理数据。实时定量RT-PCR(real time reverse transcription-polymerase chain reaction)验证基因芯片结果中部分差异表达基因,包括EMT主要差异标志基因(TGFBR2、SMAD5、FSP1和N-Cadherin)和Wnt/β-Catenin信号转导通路主要差异表达基因(DKK4、FZD2、FRAT1和AXIN1)。二、HNF4α对肝癌细胞EMT过程的作用采用实时定量RT-PCR方法检测AdHNF4α和对照病毒AdGFP感染Hep3B细胞和HepG2细胞72小时后,EMT过程主要标志基因(TGFBR2、SMAD5、FSP1、N-Cadherin、E-Cadherin、Vimentin、Fibronectin 1、plakoglobin、ZO-1、TGFβ1和SMAD2)的表达水平。以免疫荧光细胞化学方法检测AdHNF4α和AdGFP感染Hep3B及HepG2后EMT过程主要标志蛋白E-Cadherin、Vimentin和TGFβ1表达情况。将Hep3B细胞接种于裸鼠腋窝皮下建立人肝癌小鼠皮下种植瘤模型,造模成功后分别以AdHNF4α和AdGFP进行瘤内注射4次,处死裸鼠获得种植瘤组织标本,免疫组织化学方法检测上皮标志E-Cadherin和间质标志Vimentin的表达。三、HNF4α对肝癌细胞Wnt/β-Catenin信号转导通路的作用实时定量RT-PCR测定AdHNF4α作用于Hep3B细胞和HepG2细胞后,Wnt/β-Catenin信号通路主要基因(DKK4、FZD2、FRAT1、AXIN1、β-Catenin、GSK-3β和DSH)表达水平的变化。采用免疫荧光细胞化学方法在Hep3B及HepG2细胞上检测Wnt/β-Catenin信号转导通路核心蛋白β-Catenin和主要差异表达蛋白DKK4。免疫组织化学方法检测裸鼠皮下肝癌种植瘤内注射AdHNF4α和AdGFP后β-Catenin和DKK4的表达情况。【实验结果】一、HNF4α对Hep3B细胞基因表达谱的影响AdHNF4α感染Hep3B细胞48小时后363个基因上调, 435个基因下调;72小时1,058个基因上调,1,375个基因下调;48小时及72小时两时间点286个基因共同上调, 148个基因共同下调。其中,两个时间点的上调基因主要参与的生物学进程为代谢进程、生物学调节、发育进程、细胞交流、解剖学结构发生、器官发育、信号转导、细胞分化、细胞死亡和细胞凋亡等;主要分子学功能为蛋白结合、催化活性、转移酶活性、转录调节和转录因子活性等。下调基因主要参与的生物学进程为发育、定位和转运进程等;主要分子学功能为催化活性、酶调节活性等。实时定量RT-PCR表明EMT标志基因(TGFBR2、SMAD5、FSP1和N-cadherin)及Wnt/β-Catenin信号转导通路主要差异基因(DKK4、FZD2、FRAT1和AXIN1)感染AdHNF4α和AdGFP后,在48小时和72小时两个时间点的变化情况均与基因芯片结果吻合良好。二、HNF4α对肝癌细胞EMT过程的作用Hep3B和HepG2感染AdHNF4α及AdGFP病毒72小时后检测EMT标志基因TGFBR2、SMAD5、N-Cadherin和FSP1,均与基因芯片一致,并发现E-Cadherin、Vimentin、Fibronectin 1、plakoglobin、ZO-1、TGFβ1和SMAD2等指标均有显著差异,符合逆转EMT过程的变化。免疫荧光细胞化学显示Hep3B和HepG2细胞感染AdHNF4α病毒72小时后,上皮指标E-Cadherin均明显上调,间质指标TGFβ1均出现下调,Vimentin在Hep3B中表达水平降低。免疫组织化学进一步证实AdHNF4α可明显上调人肝癌小鼠皮下种植瘤中E-Cadherin水平,并显著下调Vimentin表达。表明HNF4α对肝肿瘤细胞EMT过程具有逆转作用。三、HNF4α对肝癌细胞Wnt/β-Catenin信号转导通路的作用实时定量RT-PCR结果显示Wnt/β-Catenin信号转导通路中主要基因表达情况与基因芯片结果一致,免疫荧光细胞化学进一步证实在蛋白水平上,DKK4表达明显上调,而β-Catenin表达水平降低;并且在Hep3B中可见到β-Catenin表达位置由细胞核、细胞浆向细胞膜转移。免疫组织化学显示小鼠肝癌皮下种植瘤内注射AdHNF4α后,DKK4水平显著升高,β-Catenin出现表达下调。表明HNF4α对肝肿瘤细胞Wnt/β-Catenin信号转导通路具有抑制作用。【结论】1. HNF4α可促进肝癌细胞向肝细胞分化,并诱导代谢、发育和信号转导等大量基因差异表达。2. HNF4α可逆转肝癌细胞上皮细胞间质转型过程。3. HNF4α可能通过抑制Wnt/β-Catenin信号转导通路而诱导肝癌细胞分化。