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甲萘醌（Menaquinone,MK）是一类广泛存在于微生物细胞内的化合物,在孢子形成、氧化磷酸化和电子传递等方面起着重要的作用。甲萘醌又被称为维生素K2,它们是维生素K依赖蛋白谷氨酸残基翻译后转化的重要辅助因子。目前,发现有14种MK-n,其中n为侧链上的异戊二烯单位数,这条侧链的长度因微生物的不同而不同。其中,MK-4在凝血、预防骨质疏松、缓解心血管钙化、预防糖尿病和抑制炎症等方面具有重要作用。然而,化学合成方法通常存在反应步骤复杂、产率低等缺点,还会产生低活性的顺式异构体,同时伴随着大量副产物的生成。因此,本论文拟利用代谢工程和合成生物学的方法,通过模块组装工程、群体响应动态调控、CRISPR interference（CRISPRi）系统动态调控及质膜稳态调控的技术手段,提高枯草芽孢杆菌中MK-4的合成效率。论文的主要研究结果如下:（1）解析了枯草芽孢杆菌中甲萘醌的代谢合成途径。由于野生型B.subtilis检测不到MK-4产物,将源于Synechocystis sp.PCC 6803的men A基因和men G基因整合到B.subtilis 168基因组中,构建MK-4的代谢合成途径,可初步检测到MK-4产物。进一步整合来源于集胞藻的crt E基因以提高MK-4的产量。最后,敲除hep T基因,可以使甲萘醌的代谢途径更多地流向MK-4的合成。摇瓶中重组菌株BY03的MK-4产量达到31.53±0.95 mg/L,且对细胞生长无显著影响,产率为3.60±0.11 mg/（L·g DCW）,生产强度为0.19±0.01 mg/（L·h）。（2）模块途径工程策略加强MK-4的合成。针对异戊二烯合成途径是甲萘醌类合成的限速步骤,首先加强异戊二烯合成途径模块中基因dxs、dxr和isp D-isp F的表达,并通过外源甲羟戊酸途径的整合加强异戊二烯基二磷酸的合成,将外源基因mva S、mva A、mva K1、mva K2和mva D整合表达,实现IPP的积累,MK-4产量增加了15.5%。进一步加强甲萘醌合成模块中基因表达,MK-4的产量增加了33.3%,达到120.1±0.6mg/L。采用BY23菌株进行3-L罐发酵,产量达到145±2.8 mg/L,产率为11.84±0.23mg/（L·g DCW）,生产强度为1.01±0.02 mg/（L·h）。（3）构建群体响应调控Phr Q-Rap Q-Com A系统提高MK-4的产量。比较分析Com A作用的启动子,发现rap C、rap A、rap F和srff AA启动子的强度较高;通过对启动子rap C、rap A、rap F和srff AA进行突变,筛选出启动子srf AA11的荧光强度最高;成功构建Phr Q-Rap Q-Com A QS系统可以作为一个开关依赖于细胞密度来增加靶基因的转录。Com A-P可以通过Rap Q蛋白和信号分子Phr Q的调节发挥作用。应用Phr Q-Rap Q-Com A系统对三个关键基因isp H、crt E和men A的表达进行调控,MK-4产量达到178.9±2.8mg/L,是对照菌株的1.49倍。采用BC04菌株进行3-L罐发酵,产量达到217±4.1 mg/L,产率为22.14±0.42 mg/（L·g DCW）,生产强度为1.81±0.03 mg/（L·h）。（4）应用CRISPRi系统提高MK-4的积累。对竞争途径中的关键基因分别设计了8个不同抑制效率的sg RNAs,筛选到可以有效提高MK-4的sg RNAs,包括sg RNA-pykb、sg RNA-dhb Bg、sg RNA-dhb Bh、sg RNA-uppsb和sg RNA-uppsg,进一步对竞争途径中的3个关键基因同时下调,有效地弱化了竞争途径的代谢流,MK-4的产量达到197.10±2.32mg/L。同时,分析细胞膜成分信号转导蛋白Tat AD-CD和细胞色素c还原酶Qcr A-C对MK-4合成的影响,使MK-4产量增加了8.17%,达到213.21±2.37 mg/L。进一步对发酵条件进行优化,在诱导时间为8 h、木糖添加量为18 g/L的条件下,MK-4合成模块和竞争途径之间达到最佳代谢通量的平衡,MK-4的最高含量达到221.36±2.17 mg/L。在3-L发酵罐中,菌株的MK-4最终产量为232.38±2.26 mg/L,产率为22.89±0.22mg/（L·g DCW）,生产强度为1.94±0.02 mg/（L·h）。（5）调控质膜稳态提高MK-4的积累。为了获得一株MK-4的高产菌株,对细胞膜的稳态进行了系统的分析和优化。首先,对出发菌株细胞膜的完整性相关基因进行整合分析,发现膜蛋白相关基因srf AD对MK-4的积累有重要的影响。然后,对流动性和渗透性相关基因进行整合分析,找到了影响MK-4积累的基因ypk P和fad R。通过组合优化,确定优势菌株为BF14,其整合了基因srf AD和ypk P并敲除基因fad R。BF14产量达到213.80±2.16 mg/L,比优化前提高了19.51%。在此基础上进行3-L发酵罐的发酵,MK-4产量达到249.65±2.34 mg/L,产率为24.18±0.23 mg/（L·g DCW）,生产强度为2.08±0.02 mg/（L·h）。