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猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)可以引起妊娠母猪的繁殖障碍(后期流产、死胎、木乃伊胎、弱胎)及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病(间质性肺炎),PRRSV感染可导致猪体免疫抑制。国外体外试验证明,PRRSV NSP1、NSP2、NSP4和NSP11能抑制IFN-β启动子活性,从而在体外能抑制I型干扰素的产生,但体内试验尚未报道。本研究将PRRSV非结构蛋白NSP1、NSP2和NSP4进行克隆鉴定,设计构建分别表达NSP1、NSP2和NSP4的重组腺病毒,小鼠免疫试验证明NSP1具有较强的免疫抑制作用,并通过体外PAM细胞实验和猪体内细胞免疫和体液免疫试验证实NSP1具有免疫抑制作用。主要研究内容分为以下4个部分：1、PRRSV NSP1、NSP2(1-484)和NSP4原核表达与抗体制备将PRRSV SY0608株非结构蛋白NSP1、NSP2(1-484)和NSP4基因克隆于pGEX-6P-l载体中,转化大肠杆菌BL21用0.5mM IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳结果分析NSP1.NSP2(1-484)和NSP4基因获得高量表达,大小分别约为69kDa、77kDa和48kDa,与预期结果相符,表达产物以融合蛋白包涵体形式存在。Western blotting结果表明,融合表达的GST-NSP1、GST-NSP2(1-484)、GST-NSP4蛋白能与PRRSV感染猪血清发生特异性反应,证明其抗原性良好。经包涵体洗夜裂解后得到纯化蛋白GST-NSP1、GST-NSP2(1-484)和GST-NSP4,分别免疫ICR小鼠,获得多克隆抗体。间接免疫荧光试验证明,该抗体能与PRRSV SY0608毒株产生特异性反应,从而为非结构蛋白特性研究奠定了基础。2、PRRSV NSP1、NSP2和NSP4重组腺病毒的构建与鉴定利用RT-PCR扩增出高致病性PRRSV SY0608株的NSP1、NSP2和NSP4基因,构建穿梭载体pShuttle-CMV-NSP1、pShuttle-CMV-NSP2和pShuttle-CMV-NSP4,经PCR和基因测序鉴定正确。PmeI线性化后在BJ5183大肠杆菌内与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组,得到重组腺病毒阳性质粒。重组腺病毒质粒经PacI线性化后用脂质体转染HEK-293A细胞,在细胞内包装成完整的腺病毒,IFA和westernblotting结果表明,NSP1、NSP2和NSP4重组腺病毒可以正确地表达目的蛋白。3、PRRSV NSP1、NSP2和NSP4重组腺病毒小鼠免疫抑制研究高致病性PRRSV是目前危害我国养猪业重要病原之一,但其致病机制尚不十分清楚。本试验在构建3株重组腺病毒的基础上,对其免疫特性在小鼠模型上进行了研究。75只ICR小鼠随机分为5组,每组15只。第1、2组分别注射DMEM和wtAd(野生型腺病毒)作为对照组,第3-5组分别背部皮下免疫重组腺病毒rAd-NSP1、rAd-NSP2和rAd-NSP4,间隔二周用同样方法加强免疫一次。免疫后不同时间取脾脏淋巴细胞体外培养,进行淋巴细胞增殖试验,并用ELISA检测淋巴细胞上清中IFN-y和IL-10,结果为,与wtAd或DMEM对照组相比,rAd-NSP1、 rAd-NSP2和rAd-NSP4组T淋巴细胞增殖指数(SI)和IFN-y显著降低,IL-10明显增高(P<0.05),但以rAd-NSP1组降低或升高幅度最大,证明高致病性PRRSVNSP1蛋白具有较强的免疫抑制作用。4、PRRSVNSP1对猪体免疫抑制作用为了研究高致病性PRRSV NSP1蛋白的免疫作用,本研究将高致病性PRRSV NSP1重组腺病毒(rAd-NSP1)接种体外培养的猪肺泡细胞(PAM),用实时荧光定量PCR和ELISA方法分别检测PAM细胞上清中IFN-y和IL-10水平,结果为rAd-NSP1接种PAM细胞72h后可显著降低细胞上清中IFN-y的水平,而IL-10的含量显著提高。将rAd-NSP1接种无PRRSV感染的30日龄商品仔猪,分别检测其外周血液淋巴细胞增殖作用和IFN-y和IL-10水平,结果显示,NSP1可显著降低淋巴细胞增殖和IFN-y的表达,同时诱导产生较强的IL-10反应。采用无PRRSV感染的30日龄商品仔猪免疫猪瘟疫苗后1周接种rAd-NSP1,结果猪瘟抗体的水平明显低于wtAd组(P<0.05),证明高致病性PRRSVNSP1蛋白具有免疫抑制作用。