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随着石油的短缺和对环境保护意识的重新重视,通过植物油和短链醇类的转酯反应所生产的生物柴油(脂肪酸甲酯),被认为是石化柴油最重要的替代品之一。到目前为止,商业生物柴油主要是由化学方法产生的,过度的能源消耗和环境污染是其主要的缺点。在非水介质中,脂肪酶(EC 3.1.1.3)表现出了新的酯交换特性,使其成为催化制备生物柴油的生物催化剂之一。与化学方法相比,酶法具有能量消耗低、产物回收简单、二次污染小等优点,表现出了极大的优势。但是脂肪酶的生产成本限制了酶法催化生物柴油在工业化上的应用,为了使酶法制备生物柴油在经济上比化学法更具竞争力,构建一株稳定、表达量高的脂肪酶工程菌株,并实现其高水平生产对其工业应用至关重要。嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)中提取的脂肪酶TLL具有较高的稳定性,对有机溶剂具有耐受性,且在非水介质中具有较高的转酯催化效率。TLL脂肪酶被认为是一种优秀的生物柴油转酯催化剂。在本研究中,我们首先实现了疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶(以下简称TLL)的基因结构改造、基因剂量提升和密码子优化等手段,提高了TLL脂肪酶在毕赤酵母体系中的表达能力,酶活达到了432 U/mL,蛋白含量达到了1.58 mg/mL。通过14 L发酵罐发酵,进一步获得了875 U/mL,3.22 mg/mL的液体脂肪酶酶液,然后使用高效表达重组子发酵获得的液体TLL脂肪酶催化油脂与醇类进行生物柴油催化反应,经过TLL脂肪酶的酶学性质和生物柴油催化反应参数的探索,使用液体TLL脂肪酶的转酯率达到了96%。直接使用液体脂肪酶催化生物柴油转酯反应的策略有效的提升了TLL脂肪酶的回收能力,减少了因固定化过程带来的成本二次增加,为大规模工业生产提供了一种具有可行性的新工艺,为实现进一步酶法制备生物柴油产业化打下了坚实的基础。