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骨质疏松症(Osteoporosis, OP)是一种以骨量降低，骨组织微结构破坏，导致骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性代谢性骨病。随着人口老龄化进展，骨质疏松症发病率逐年上升，骨折风险增加，尤其合并糖尿病，一旦骨折，患者生活质量将进一步降低。骨质疏松症的发病机制涉及组织、细胞及分子水平的某些改变，相关信号转导犹如疾病的“总开关”，将多种内分泌、神经内分泌、炎症或机械应激串联放大。从细胞水平上看，这些枢纽因子参与不同类型骨细胞之间的信号转导，影响骨形成和骨吸收过程，是重塑骨代谢平衡的关键因素。因此，有必要进一步探索关键因子参与骨代谢的分子机制，为骨质疏松症的临床管理提供依据。
胰岛素受体底物(Insulin Receptor Substrate, IRS)是胰岛素/胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor 1, IGF-1)信号通路的受体后锚定蛋白。IRS目前已发现4个亚类，其中，IRS-1分布最广泛，可表达于外周组织如骨骼肌、肝脏、肾脏和骨组织等，是导致胰岛素抵抗的候选基因之一。近来，IRS-1在骨代谢中的作用越来越受到重视。我们前期研究发现，骨质疏松大鼠及糖尿病合并骨质疏松大鼠其骨骼肌、肝脏、肾脏和骨组织中IRS-1表达明显低于健康对照组及假手术组大鼠，且IRS-1在骨组织中的下降程度及变化速度最明显。动物实验证实，IRS-1基因自发性突变小鼠影响其成年骨骼表型。据报道，IRS-1与人和小鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMSCs)成骨/成脂分化相关，但其具体过程及相关机制有待深入研究。
具有盘状同源区域结合序列的转录共活化因子(Transcriptional co-activator with PDZ-binding motif, TAZ)，是一种类似β-连环蛋白(β-catenin)的分子，它被证实能够调节BMSCs成骨-成脂分化平衡。据悉，TAZ可以通过上调Runt相关转录因子2(Runt related transcription factor 2, RUNX2)促进成骨分化，下调过氧化物酶体增殖体激活受体γ(Peroxisomeproliferatoractivatedreceptorγ,PPARγ)抑制成脂分化，具有双向调节作用。同样，我们前期研究发现，IGF-1便是通过上调TAZ促进大鼠BMSCs向成骨细胞分化。随后，有研究证实，转化生长因子β1(Transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)同样可以通过上调TAZ促进成骨分化，并引用了我们上述研究。但是，TAZ能否作为IRS-1下游靶基因，调控BMSCs成骨-成脂分化呢？这些问题尚未可知，尤其是在骨质疏松发病进程中。
骨质疏松症发病机制与未分化干细胞向成骨细胞分化能力降低，直接或间接导致骨形成下降、骨吸收增加，其核心是成骨细胞数量和功能的低下。骨质疏松患者BMSCs向成脂细胞分化明显增加，向成骨细胞分化明显减少。但是，目前临床上治疗骨质疏松症多以抑制骨吸收药物为主，减少骨量丢失，虽然一定程度上可以改善症状，但费用高且存在不良反应，治疗周期长且依从性差。因此，探索新疗法的研究一直方兴未艾。近来，采用基因修饰干细胞移植有望从源头上增加成骨细胞数量，以促进骨形成，改善骨代谢平衡，治疗骨质疏松症，这一新疗法逐渐引起科学界的广泛关注。基因修饰干细胞或可通过诱导BMSCs向成骨细胞分化，减少其向成脂细胞分化，直接或间接促进骨形成。此外，BMSCs尚具有免疫抑制特性，被美国国家食品与药物管理局(Food and Drug Administration, FDA)认为安全且有效，是体内重塑骨-脂平衡的新希望。综上，本研究旨在阐明IRS-1-TAZ信号转导调控BMSCs增殖及成骨-成脂分化平衡的潜在分子机制，为基因修饰干细胞治疗骨质疏松症提供新靶点和新依据。
第一部分IRS-1/TAZ基因修饰调节BMSCs成骨/成脂分化细胞增殖
目的：
观察IRS-1/TAZ基因修饰对BMSCs成骨/成脂分化进程中细胞增殖的影响。
方法：
1.IRS-1或TAZ基因修饰质粒及其阴性对照质粒转染BMSCs，采用实时荧光定量PCR(real-time RT-PCR)和免疫沉淀(western blot)分析法验证目的基因表达情况；
2.BMSCs转染后诱导其向成骨细胞分化，采用MTT法检测过表达或敲低IRS-1或敲低TAZ表达后细胞增殖活性；采用流式细胞分析技术检测细胞周期百分比，评估IRS-1/TAZ基因修饰对成骨分化细胞增殖的影响；
3.BMSCs转染后诱导其向成脂细胞分化，采用MTT法检测过表达或敲低IRS-1或敲低TAZ表达后细胞增殖活性，采用流式细胞分析技术检测细胞周期百分比，评估IRS-1/TAZ基因修饰对成脂分化细胞增殖的影响；
4.BMSCs转染后，采用real-timeRT-PCR和westernblot技术分析过表达或敲低IRS-1或敲低TAZ表达后细胞周期标志物CyclinB1、CyclinD1mRNA水平及蛋白表达情况，明确IRS-1/TAZ基因修饰调控BMSCs细胞增殖的潜在分子机制。
结果：
1.IRS-1或TAZ基因修饰质粒转染BMSCs，与未转染及阴性质粒转染细胞相比，过表达IRS-1质粒转染后细胞IRS-1表达上调，敲低IRS-1或敲低TAZ质粒转染后细胞IRS-1或TAZ表达下调；
2.BMSCs成骨分化进程中，过表达或敲低IRS-1不影响细胞活性，不改变细胞周期百分比；敲低TAZ明显降低细胞活性和增殖期细胞比例，抑制成骨分化细胞增殖；
3.BMSCs成脂分化进程中，过表达IRS-1不影响细胞活性，不改变细胞周期百分比；敲低IRS-1或敲低TAZ明显降低细胞活性和增殖期细胞比例，抑制成脂分化细胞增殖；
4.过表达IRS-1上调CyclinB1、CyclinD1mRNA及蛋白水平，敲低IRS-1或敲低TAZ下调CyclinB1、CyclinD1mRNA及蛋白水平。
第二部分IRS-1上调TAZ促进BMSCs向成骨细胞分化
目的：
探索IRS-1-TAZ信号转导机制及其对BMSCs成骨分化的影响。
方法：
1.诱导BMSCs向成骨细胞分化，于3天、7天、14天收集细胞，采用real-timeRT-PCR和westernblot技术分析IRS-1、TAZ及成骨分化标志物RUNX2、骨钙素(Osteocalcin, OCN)mRNA水平和蛋白表达情况；
2.SiIRS-1或SiTAZ质粒及其阴性对照质粒(包含相同抗性的空载质粒，命名为CON36)转染BMSCs，同时添加成骨分化诱导剂，采用real-timeRT-PCR和westernblot技术分析IRS-1、TAZ及成骨分化标志物RUNX2、OCNmRNA水平和蛋白表达情况，检测ALP活性，茜素红染色及半定量分析成骨结节形成情况；
3.IRS-1过表达质粒及其阴性对照质粒(CON83)转染BMSCs，同时添加成骨分化诱导剂，采用real-timeRT-PCR和westernblot技术分析IRS-1、TAZ及成骨分化标志物RUNX2、OCNmRNA水平和蛋白表达情况，检测ALP活性，茜素红染色及半定量分析成骨结节形成情况；
4.IRS-1过表达质粒及SiTAZ质粒共转染BMSCs，以阴性质粒共转染(CON36+CON83)及未转染细胞为阴性对照组，以IRS-1过表达+CON36或SiTAZ质粒+CON83共转染细胞为阳性对照组，采用real-timeRT-PCR和westernblot技术分析IRS-1、TAZ及成骨分化标志物RUNX2、CONmRNA水平和蛋白表达情况；
5.IRS-1过表达质粒及其阴性对照质粒转染BMSCs，同时添加PI3K-Akt通路抑制剂LY294002或者MEK-ERK通路抑制剂U0126，并诱导其向成骨细胞分化，采用real-timeRT-PCR和westernblot技术分析TAZmRNA水平和蛋白表达情况，明确IRS-1靶向调控TAZ表达的分子通路。
结果：
1.BMSCs向成骨细胞分化时，IRS-1表达早期升高，7天达峰，7-14天表达呈现降低趋势；TAZ表达趋势与IRS-1相似；成骨分化早期标志物RUNX2表达3天达峰，3-14天缓慢降低；成骨分化晚期标志物OCN早期缓慢升高，7-14天快速增加；
2.BMSCs向成骨细胞分化时，敲低IRS-1，则TAZ表达随之降低，成骨分化标志物RUNX2、OCN表达下调，ALP活性降低，钙结节形成减少；且SiIRS-1与SiTAZ质粒转染组降低程度持平；
3.BMSCs向成骨细胞分化时，过表达IRS-1，则TAZ表达随之升高，成骨分化标志物RUNX2、OCN表达上调，ALP活性升高，钙结节形成增多；表明IRS-1靶向TAZ参与调控BMSCs向成骨细胞分化；
4.BMSCs向成骨细胞分化时，采用共转染试验进一步验证IRS-1靶向TAZ信号转导机制。敲低TAZ中和了过表达IRS-1所上调的成骨分化标志物RUNX2、OCN表达；反之，过表达IRS-1逆转了敲低TAZ所下调的成骨分化标志物RUNX2、OCN表达。有趣的是，敲低TAZ可引起IRS-1表达下调，提示IRS-1和TAZ之间存在相互作用，形成反馈环路；
5.BMSCs向成骨细胞分化时，PI3K-Akt通路抑制剂LY294002，而非MEK-ERK通路抑制剂U0126，抵消了过表达IRS-1所上调的TAZ表达。说明BMSCs成骨分化时，IRS-1通过PI3K-Akt通路调节TAZ表达。
第三部分IRS-1靶向TAZ抑制BMSCs向成脂细胞分化
目的：
明确IRS-1-TAZ信号转导机制及其对BMSCs成脂分化的影响。
方法：
1.诱导BMSCs向成脂细胞分化，于3天、7天、14天收集细胞，采用real-timeRT-PCR和westernblot技术分析IRS-1、TAZ及成脂分化标志物CCAAT-增强子结合蛋白β(CCAAT/enhancerbindingproteinβ,C/EBPβ)、PPARγmRNA水平和蛋白表达情况；
2.IRS-1过表达质粒及其阴性对照质粒转染BMSCs，同时添加成脂分化诱导剂，采用real-timeRT-PCR和westernblot技术分析IRS-1、TAZ及成脂分化标志物C/EBPβ、PPARγmRNA水平和蛋白表达情况，油红O染色及半定量分析脂滴形成情况；
3.SiIRS-1或SiTAZ质粒及其阴性对照质粒转染BMSCs，同时添加成脂分化诱导剂，采用real-timeRT-PCR和westernblot技术分析IRS-1、TAZ及成脂分化标志物C/EBPβ、PPARγmRNA水平和蛋白表达情况，油染O色及半定量分析脂滴形成情况；
4.IRS-1过表达质粒及SiTAZ质粒共转染BMSCs，以阴性质粒共转染(CON36+CON83)及未转染细胞为阴性对照组，以IRS-1过表达+CON36或SiTAZ质粒+CON83共转染细胞为阳性对照组，采用real-timeRT-PCR和westernblot技术分析IRS-1、TAZ及成脂分化标志物C/EBPβ、PPARγmRNA水平和蛋白表达情况；
5.IRS-1过表达质粒及其阴性对照质粒转染BMSCs，同时或添加PI3K-Akt通路抑制剂LY294002或者MEK-ERK通路抑制剂U0126，并诱导其向成脂细胞分化，采用real-timeRT-PCR和westernblot技术分析TAZmRNA水平和蛋白表达情况。
结果：
1.BMSCs向成脂细胞分化时，IRS-1和TAZ表达早期降低，7天最低，7-14天表达缓慢升高；成脂分化早期标志物C/EBPβ表达早期升高，7天达峰，7-14天保持峰值；成脂分化晚期标志物PPARγ早期缓慢升高，7-14天快速增加；
2.BMSCs向成脂细胞分化时，过表达IRS-1，则TAZ表达随之升高，成脂分化标志物C/EBPβ、PPARγ表达下调，脂滴形成减少；
3.BMSCs向成脂细胞分化时，敲低IRS-1，则TAZ表达随之降低，成脂分化标志物C/EBPβ、PPARγ表达上调，脂滴形成增加；且SiIRS-1与SiTAZ质粒转染组表达改变程度持平；
4.BMSCs向成脂细胞分化时，采用共转染试验进一步验证IRS-1靶向TAZ信号转导机制。敲低TAZ中和了过表达IRS-1所下调的成脂分化标志物C/EBPβ、PPARγ表达；反之，过表达IRS-1逆转了敲低TAZ所上调的成脂分化标志物C/EBPβ、PPARγ表达；此外，敲低TAZ反过来导致IRS-1表达下调，提示IRS-1和TAZ之间相互作用，形成反馈环路；
5.BMSCs向成脂细胞分化时，PI3K-Akt通路抑制剂LY294002及MEK-ERK通路抑制剂U0126部分抵消过表达IRS-1所上调的TAZ表达，提示BMSCs成脂分化时，IRS-1通过PI3K-Akt及MEK-ERK通路调节TAZ表达。
结论：
1.IRS-1/TAZ基因修饰均参与调节细胞增殖，且在BMSCs分化进程中不存在毒性作用；
2.IRS-1激活PI3K-Akt而非MEK-ERK通路上调TAZ表达，促进BMSCs向成骨细胞分化；
3.IRS-1激活PI3K-Akt和MEK-ERK通路上调TAZ表达，抑制BMSCs向成脂细胞分化。
胰岛素受体底物(Insulin Receptor Substrate, IRS)是胰岛素/胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor 1, IGF-1)信号通路的受体后锚定蛋白。IRS目前已发现4个亚类，其中，IRS-1分布最广泛，可表达于外周组织如骨骼肌、肝脏、肾脏和骨组织等，是导致胰岛素抵抗的候选基因之一。近来，IRS-1在骨代谢中的作用越来越受到重视。我们前期研究发现，骨质疏松大鼠及糖尿病合并骨质疏松大鼠其骨骼肌、肝脏、肾脏和骨组织中IRS-1表达明显低于健康对照组及假手术组大鼠，且IRS-1在骨组织中的下降程度及变化速度最明显。动物实验证实，IRS-1基因自发性突变小鼠影响其成年骨骼表型。据报道，IRS-1与人和小鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMSCs)成骨/成脂分化相关，但其具体过程及相关机制有待深入研究。
具有盘状同源区域结合序列的转录共活化因子(Transcriptional co-activator with PDZ-binding motif, TAZ)，是一种类似β-连环蛋白(β-catenin)的分子，它被证实能够调节BMSCs成骨-成脂分化平衡。据悉，TAZ可以通过上调Runt相关转录因子2(Runt related transcription factor 2, RUNX2)促进成骨分化，下调过氧化物酶体增殖体激活受体γ(Peroxisomeproliferatoractivatedreceptorγ,PPARγ)抑制成脂分化，具有双向调节作用。同样，我们前期研究发现，IGF-1便是通过上调TAZ促进大鼠BMSCs向成骨细胞分化。随后，有研究证实，转化生长因子β1(Transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)同样可以通过上调TAZ促进成骨分化，并引用了我们上述研究。但是，TAZ能否作为IRS-1下游靶基因，调控BMSCs成骨-成脂分化呢？这些问题尚未可知，尤其是在骨质疏松发病进程中。
骨质疏松症发病机制与未分化干细胞向成骨细胞分化能力降低，直接或间接导致骨形成下降、骨吸收增加，其核心是成骨细胞数量和功能的低下。骨质疏松患者BMSCs向成脂细胞分化明显增加，向成骨细胞分化明显减少。但是，目前临床上治疗骨质疏松症多以抑制骨吸收药物为主，减少骨量丢失，虽然一定程度上可以改善症状，但费用高且存在不良反应，治疗周期长且依从性差。因此，探索新疗法的研究一直方兴未艾。近来，采用基因修饰干细胞移植有望从源头上增加成骨细胞数量，以促进骨形成，改善骨代谢平衡，治疗骨质疏松症，这一新疗法逐渐引起科学界的广泛关注。基因修饰干细胞或可通过诱导BMSCs向成骨细胞分化，减少其向成脂细胞分化，直接或间接促进骨形成。此外，BMSCs尚具有免疫抑制特性，被美国国家食品与药物管理局(Food and Drug Administration, FDA)认为安全且有效，是体内重塑骨-脂平衡的新希望。综上，本研究旨在阐明IRS-1-TAZ信号转导调控BMSCs增殖及成骨-成脂分化平衡的潜在分子机制，为基因修饰干细胞治疗骨质疏松症提供新靶点和新依据。
第一部分IRS-1/TAZ基因修饰调节BMSCs成骨/成脂分化细胞增殖
目的：
观察IRS-1/TAZ基因修饰对BMSCs成骨/成脂分化进程中细胞增殖的影响。
方法：
1.IRS-1或TAZ基因修饰质粒及其阴性对照质粒转染BMSCs，采用实时荧光定量PCR(real-time RT-PCR)和免疫沉淀(western blot)分析法验证目的基因表达情况；
2.BMSCs转染后诱导其向成骨细胞分化，采用MTT法检测过表达或敲低IRS-1或敲低TAZ表达后细胞增殖活性；采用流式细胞分析技术检测细胞周期百分比，评估IRS-1/TAZ基因修饰对成骨分化细胞增殖的影响；
3.BMSCs转染后诱导其向成脂细胞分化，采用MTT法检测过表达或敲低IRS-1或敲低TAZ表达后细胞增殖活性，采用流式细胞分析技术检测细胞周期百分比，评估IRS-1/TAZ基因修饰对成脂分化细胞增殖的影响；
4.BMSCs转染后，采用real-timeRT-PCR和westernblot技术分析过表达或敲低IRS-1或敲低TAZ表达后细胞周期标志物CyclinB1、CyclinD1mRNA水平及蛋白表达情况，明确IRS-1/TAZ基因修饰调控BMSCs细胞增殖的潜在分子机制。
结果：
1.IRS-1或TAZ基因修饰质粒转染BMSCs，与未转染及阴性质粒转染细胞相比，过表达IRS-1质粒转染后细胞IRS-1表达上调，敲低IRS-1或敲低TAZ质粒转染后细胞IRS-1或TAZ表达下调；
2.BMSCs成骨分化进程中，过表达或敲低IRS-1不影响细胞活性，不改变细胞周期百分比；敲低TAZ明显降低细胞活性和增殖期细胞比例，抑制成骨分化细胞增殖；
3.BMSCs成脂分化进程中，过表达IRS-1不影响细胞活性，不改变细胞周期百分比；敲低IRS-1或敲低TAZ明显降低细胞活性和增殖期细胞比例，抑制成脂分化细胞增殖；
4.过表达IRS-1上调CyclinB1、CyclinD1mRNA及蛋白水平，敲低IRS-1或敲低TAZ下调CyclinB1、CyclinD1mRNA及蛋白水平。
第二部分IRS-1上调TAZ促进BMSCs向成骨细胞分化
目的：
探索IRS-1-TAZ信号转导机制及其对BMSCs成骨分化的影响。
方法：
1.诱导BMSCs向成骨细胞分化，于3天、7天、14天收集细胞，采用real-timeRT-PCR和westernblot技术分析IRS-1、TAZ及成骨分化标志物RUNX2、骨钙素(Osteocalcin, OCN)mRNA水平和蛋白表达情况；
2.SiIRS-1或SiTAZ质粒及其阴性对照质粒(包含相同抗性的空载质粒，命名为CON36)转染BMSCs，同时添加成骨分化诱导剂，采用real-timeRT-PCR和westernblot技术分析IRS-1、TAZ及成骨分化标志物RUNX2、OCNmRNA水平和蛋白表达情况，检测ALP活性，茜素红染色及半定量分析成骨结节形成情况；
3.IRS-1过表达质粒及其阴性对照质粒(CON83)转染BMSCs，同时添加成骨分化诱导剂，采用real-timeRT-PCR和westernblot技术分析IRS-1、TAZ及成骨分化标志物RUNX2、OCNmRNA水平和蛋白表达情况，检测ALP活性，茜素红染色及半定量分析成骨结节形成情况；
4.IRS-1过表达质粒及SiTAZ质粒共转染BMSCs，以阴性质粒共转染(CON36+CON83)及未转染细胞为阴性对照组，以IRS-1过表达+CON36或SiTAZ质粒+CON83共转染细胞为阳性对照组，采用real-timeRT-PCR和westernblot技术分析IRS-1、TAZ及成骨分化标志物RUNX2、CONmRNA水平和蛋白表达情况；
5.IRS-1过表达质粒及其阴性对照质粒转染BMSCs，同时添加PI3K-Akt通路抑制剂LY294002或者MEK-ERK通路抑制剂U0126，并诱导其向成骨细胞分化，采用real-timeRT-PCR和westernblot技术分析TAZmRNA水平和蛋白表达情况，明确IRS-1靶向调控TAZ表达的分子通路。
结果：
1.BMSCs向成骨细胞分化时，IRS-1表达早期升高，7天达峰，7-14天表达呈现降低趋势；TAZ表达趋势与IRS-1相似；成骨分化早期标志物RUNX2表达3天达峰，3-14天缓慢降低；成骨分化晚期标志物OCN早期缓慢升高，7-14天快速增加；
2.BMSCs向成骨细胞分化时，敲低IRS-1，则TAZ表达随之降低，成骨分化标志物RUNX2、OCN表达下调，ALP活性降低，钙结节形成减少；且SiIRS-1与SiTAZ质粒转染组降低程度持平；
3.BMSCs向成骨细胞分化时，过表达IRS-1，则TAZ表达随之升高，成骨分化标志物RUNX2、OCN表达上调，ALP活性升高，钙结节形成增多；表明IRS-1靶向TAZ参与调控BMSCs向成骨细胞分化；
4.BMSCs向成骨细胞分化时，采用共转染试验进一步验证IRS-1靶向TAZ信号转导机制。敲低TAZ中和了过表达IRS-1所上调的成骨分化标志物RUNX2、OCN表达；反之，过表达IRS-1逆转了敲低TAZ所下调的成骨分化标志物RUNX2、OCN表达。有趣的是，敲低TAZ可引起IRS-1表达下调，提示IRS-1和TAZ之间存在相互作用，形成反馈环路；
5.BMSCs向成骨细胞分化时，PI3K-Akt通路抑制剂LY294002，而非MEK-ERK通路抑制剂U0126，抵消了过表达IRS-1所上调的TAZ表达。说明BMSCs成骨分化时，IRS-1通过PI3K-Akt通路调节TAZ表达。
第三部分IRS-1靶向TAZ抑制BMSCs向成脂细胞分化
目的：
明确IRS-1-TAZ信号转导机制及其对BMSCs成脂分化的影响。
方法：
1.诱导BMSCs向成脂细胞分化，于3天、7天、14天收集细胞，采用real-timeRT-PCR和westernblot技术分析IRS-1、TAZ及成脂分化标志物CCAAT-增强子结合蛋白β(CCAAT/enhancerbindingproteinβ,C/EBPβ)、PPARγmRNA水平和蛋白表达情况；
2.IRS-1过表达质粒及其阴性对照质粒转染BMSCs，同时添加成脂分化诱导剂，采用real-timeRT-PCR和westernblot技术分析IRS-1、TAZ及成脂分化标志物C/EBPβ、PPARγmRNA水平和蛋白表达情况，油红O染色及半定量分析脂滴形成情况；
3.SiIRS-1或SiTAZ质粒及其阴性对照质粒转染BMSCs，同时添加成脂分化诱导剂，采用real-timeRT-PCR和westernblot技术分析IRS-1、TAZ及成脂分化标志物C/EBPβ、PPARγmRNA水平和蛋白表达情况，油染O色及半定量分析脂滴形成情况；
4.IRS-1过表达质粒及SiTAZ质粒共转染BMSCs，以阴性质粒共转染(CON36+CON83)及未转染细胞为阴性对照组，以IRS-1过表达+CON36或SiTAZ质粒+CON83共转染细胞为阳性对照组，采用real-timeRT-PCR和westernblot技术分析IRS-1、TAZ及成脂分化标志物C/EBPβ、PPARγmRNA水平和蛋白表达情况；
5.IRS-1过表达质粒及其阴性对照质粒转染BMSCs，同时或添加PI3K-Akt通路抑制剂LY294002或者MEK-ERK通路抑制剂U0126，并诱导其向成脂细胞分化，采用real-timeRT-PCR和westernblot技术分析TAZmRNA水平和蛋白表达情况。
结果：
1.BMSCs向成脂细胞分化时，IRS-1和TAZ表达早期降低，7天最低，7-14天表达缓慢升高；成脂分化早期标志物C/EBPβ表达早期升高，7天达峰，7-14天保持峰值；成脂分化晚期标志物PPARγ早期缓慢升高，7-14天快速增加；
2.BMSCs向成脂细胞分化时，过表达IRS-1，则TAZ表达随之升高，成脂分化标志物C/EBPβ、PPARγ表达下调，脂滴形成减少；
3.BMSCs向成脂细胞分化时，敲低IRS-1，则TAZ表达随之降低，成脂分化标志物C/EBPβ、PPARγ表达上调，脂滴形成增加；且SiIRS-1与SiTAZ质粒转染组表达改变程度持平；
4.BMSCs向成脂细胞分化时，采用共转染试验进一步验证IRS-1靶向TAZ信号转导机制。敲低TAZ中和了过表达IRS-1所下调的成脂分化标志物C/EBPβ、PPARγ表达；反之，过表达IRS-1逆转了敲低TAZ所上调的成脂分化标志物C/EBPβ、PPARγ表达；此外，敲低TAZ反过来导致IRS-1表达下调，提示IRS-1和TAZ之间相互作用，形成反馈环路；
5.BMSCs向成脂细胞分化时，PI3K-Akt通路抑制剂LY294002及MEK-ERK通路抑制剂U0126部分抵消过表达IRS-1所上调的TAZ表达，提示BMSCs成脂分化时，IRS-1通过PI3K-Akt及MEK-ERK通路调节TAZ表达。
结论：
1.IRS-1/TAZ基因修饰均参与调节细胞增殖，且在BMSCs分化进程中不存在毒性作用；
2.IRS-1激活PI3K-Akt而非MEK-ERK通路上调TAZ表达，促进BMSCs向成骨细胞分化；
3.IRS-1激活PI3K-Akt和MEK-ERK通路上调TAZ表达，抑制BMSCs向成脂细胞分化。