基于Bac-to-Bac系统研究BmSPR基因在昆虫细胞的表达

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墨蝶呤还原酶(SPR)是生物体内催化GTP分解代谢合成四氢生物蝶呤(BH4)最后一步反应的关键酶。对 SPR的研究主要集中在高等脊椎动物,在昆虫中的研究报道不多。我们的前期研究表明家蚕(Bombyx mori)的SPR基因(BmSpr)是决定黄体色突变体(lem)的遗传基因,家蚕具有与哺乳动物相似的BH4从头合成途径。墨蝶呤(SP)是形成昆虫体表色的内源性色素之一,也是GTP分解代谢途径的中间产物,大量沉积于lem蚕幼虫的体表。SP也可在SPR和二氢叶酸还原酶(DHFR)的催化作用下经补救途径合成 BH4。作为芳香族氨基酸羟化酶和一氧化氮合酶的重要辅助因子,BH4的缺乏不仅可以引发苯丙酮尿症等生理代谢疾病,而且能够致使多种神经性代谢综合症,同时也是导致高血压、动脉粥样硬化、糖尿病等内皮功能异常的重要原因。本实验室近两年已经研究了BmSPR的原核表达及酶活特征,试图以从lem蚕幼虫提纯的SP为底物,通过共表达BmSPR和BmDHFR,建立体外合成BH4的实验体系。  本研究首先利用在线分析软件对BmSPR的疏水性、信号肽、亚细胞定位、功能结构域以及蛋白高级结构进行了全面的生物信息学分析和预测。其次,利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统,在两种昆虫培养细胞BmN和Sf9中进行了BmSPR的真核表达研究及重组蛋白的鉴定。  在Bac-to-Bac表达实验中,首先将BmSpr克隆到杆状病毒表达载体pFastBacHT B中,获得了重组质粒pFastBacHT B-BmSpr,再将该重组质粒分别转化到含有不同杆状病毒粒子(Bacmid)的AcMNPV和BmNPV的DH10Bac感受态细胞株。在含有能够表达转座酶的辅助质粒DH10Bac的细胞中完成同源重组,获得了重组杆状病毒,分别命名为pAc-BmSpr和pBm-BmSpr。经过验证所获得重组Bacmid准确无误后,参照Lipofectamine2000的说明书,以脂质体介导法用重组BacmidpAc-BmSpr和pBm-BmSpr分别转染相应的宿主细胞Sf9和BmN。通过多次感染,获得较高的病毒滴度后,大量感染宿主细胞,以收获重组目的蛋白BmSPR。SDS-PAGE和Western Blot的检测结果表明,重组蛋白BmSPR在两种昆虫细胞中都能够稳定地表达。  Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统具有高效安全性,并能获得生物学活性完全的目的酶蛋白。本研究为今后利用该表达系统大量表达和纯化重组 BmSPR,进一步开展BH4体外制备的应用基础研究奠定了必要的实验基础。
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