活性氧活物种（ROS,Reactive oxygen species）,是指在需氧细胞代谢过程中协同调控氧还修饰而产生的一系列氧化能力强、化学性质非常活泼的含氧物质,主要由一些O2·-（超氧阴离子自由基）、H2O2（过氧化氢）、·OH（羟基自由基）等组成。ROS能通过影响参与一系列代谢信号通路调节的特定酶等从而起到调节生理功能的作用,并在过量时,破坏正常的生理代谢。因此,ROS也与一系列如神经退行性疾病,心血管疾病的发展密切相关。甲硫氨酸是生物体内一种含有特异性甲硫键的氨基酸。甲硫键疏水性极强,能够参与蛋白质翻译起始,并同时具有维持蛋白质结构的重要疏水性的功能。其中,甲硫键上的硫原子易被含氧化合物ROS氧化形成R和S构型的甲硫氨酸亚砜（MetO）,并在加大氧化损伤的情况下,进一步被氧化成甲硫氨酸砜（MetO2）和相应的自由基。而氧化生成的甲硫氨酸亚砜侧链可以被体内甲硫氨酸亚砜还原酶（Msrs）重新还原为甲硫氨酸,因此,这种氧化-还原通过消耗ROS起到了防止氧化应激、调节信号通路的作用。近年的研究表明,体内甲硫氨酸亚砜的生成以及还原参与到多种氧化应激相关疾病的调控,如神经退行性疾病、帕金森症、阿耳茨海默病和白内障等。因此,研究蛋白质中甲硫氨酸的亚砜化对机体内正常生理过程和疾病的检测治疗方面具有十分重要的意义。本论文发展了一种能够标记蛋白质中甲硫氨酸亚砜的化学偶联反应并探讨了该标记反应的反应机制,同时合成了相应的检测试剂,并成功应用于模型重组蛋白和全蛋白中甲硫氨酸亚砜的检测。为生命体中甲硫氨酸亚砜化及其相关的生理、病理和信号转导过程研究提供了非常有力的工具。本文的主要内容包括:1.设计合成了荧光标记和生物素标记试剂,并标记了受到适量浓度双氧水和氧化时间氧化后的鸡蛋卵清白蛋白、β-乳球蛋白和钙调蛋白CaM（牛源）中不同含量的甲硫氨酸亚砜,通过凝胶电泳法和EASY-SprayTM蛋白质质谱法分别对重组蛋白中发生亚砜化的位点、标记产物的个数以及标记产物的类型进行了分析,充分证明了我们的标记方法能够高效地标记重组蛋白中的甲硫氨酸亚砜。同时通过click点击化学对β-乳球蛋白中的甲硫氨酸亚砜分步进行了标记,并分析了每一步的标记产物及标记效率;2.通过激光共聚焦显微镜成像技术和蛋白免疫印迹法对受到ROS（包括H2O2和ROS清除剂）调控后的HeLa细胞中的甲硫氨酸亚砜的含量和分布进行了定性的检测,并使用蛋白化学组学法分析了其发生亚砜化的位点;3.通过敲低HeLa细胞内转录翻译合成MsrA和MsrB2的RNA,从而降低了这两种酶在胞内的含量,使得受到这两种酶调控的胞内甲硫氨酸亚砜的含量增多,并与标记试剂反应,进一步扩充了标记方法的应用范围。同时,通过western blot,qPCR分别了验证了敲低的效率和确定了敲低效率达到最大时siRNA的最佳浓度;4.最后,本文合成了含有甲硫氨酸亚砜结构的单一氨基酸和二肽,并结合蛋白质谱的结果,分别从反应的溶剂,反应物的结构以及当量比对标记反应的反应原理进行了考察。