荧光探针能对某种特定分析物进行专一性识别检测,通过荧光信号变化来分析目标分子与荧光探针的反应过程。由于其灵敏度高、选择性好、检测成本低廉和操作简便等特点深受广大科学家青睐,而且荧光成像具有实时原位可视化检测、对检测样品损伤小、重现性能好等其他检测手段所不具备的优点。荧光探针已经在各种学科得到了广泛深入的应用,例如临床诊断学、药理学、病理学、化学生物学等,越来越成为一种必不可少的诊断分析工具。但是,荧光探针的荧光强度容易受到周围环境、自身浓度和检测仪器等因素的影响,导致检测结果的准确性降低。而同时具有两个荧光发射峰的比率型荧光探针在成像时,可以通过自身两个信号峰进行校正,避免以上因素的影响,提高检测的准确性。本文致力于提高荧光分析法的检测效率,通过分子内电荷转移和荧光能量共振转移荧光机制构建一系列比率型荧光探针。以吡咯菁、香豆素、萘酰亚胺、哌若宁和罗丹明为荧光信号团,分别设计合成了p H、硫化氢和氰根阴离子比值荧光探针。具体内容如下:(1)第二章在吡咯的2和5号位引入两个吲哚盐基团,构建了一类新型的菁类近红外染料,将其命名为吡咯菁(Py Cy)。PyCy在酸性条件下,吡咯氮会被质子化,供电子能力减弱,降低其荧光强度;在碱性条件下,吡咯氮上的质子会离去,使共轭结构发生改变,加强了分子内电子推拉作用的能力,吸收/发射光谱发生红移。所以,Py Cy可以检测宽范围的p H,并且表现出双模式的荧光信号变化。我们成功利用Py Cy2(Py Cy系列染料之一)进行线粒体细胞器p H荧光成像和实时监测碱性环境下由大肠杆菌碱性磷酸酶引起的微小p H变化。(2)第三章介绍一种新策略用于调控FRET过程,它是通过改变能量受体的吸收波长调节供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠度。基于这种策略,我们选择香豆素和萘酰亚胺作为荧光信号团,叠氮基团作为识别位点构建了比率型H2S荧光探针CN-N3,它的荧光信号变化同时受FRET和ICT机理协同调控。探针对H2S有很高的灵敏度和选择性,与H2S作用后荧光强度比值(I534/I474)增加了8.7倍,荧光也由蓝色变成了绿色。另外,我们还利用探针CN-N3成功检测了细胞外源性和内源性的H2S。(3)第四章设计合成了基于FRET机理的新型比率型H2S荧光探针(CP-H2S),香豆素作为能量供体和哌若宁作为能量受体构成的二分体是一个全新的FRET平台。探针对H2S表现除了很高的灵敏度和选择性,检测下限达到了2.2×10-7 M。探针与H2S反应后,FRET过程受阻,香豆素与哌若宁的荧光强度比值(I454/I573)增加了256.1倍,用肉眼能明显地观察到溶液荧光由红色变成了蓝色。最后,我们利用探针CP-H2S成功进行了活细胞H2S比率荧光成像。(4)第五章设计合成了一个基于香豆素-罗丹明FRET平台的比率型CN-荧光探针(CR),并对其光谱性能和与CN-的响应机理进行了详细的研究。通过浓度滴定实验发现探针CR和CN-反应后,FRET过程被阻断,香豆素与罗丹明的荧光强度比值(I4 86/I587)增加了43.1倍,而且肉眼能明显地观察到溶液荧光由红色变成了蓝色。CN-浓度在0-13.0当量范围内时,探针荧光强度比值变化与分析物浓度具有很好的线性关系,可以进行定量检测CN-。探针在生理p H范围内对H2S有很好的响应,而且有良好的细胞膜通透性,所以探针CR可以检测活细胞内氰根阴离子。