【摘 要】
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大白菜根肿病是由芸薹根肿菌侵染植株的根系、并使其根部形成根瘤的一种病害。水及营养成分向植株地上部分运输受到阻碍,从而导致产量大幅度降低。近些年,根肿病抗病分子机制也已有一些报道,一些研究者已采用转录组分析、蛋白质谱分析、RNA-Seq技术等方法筛选出大量有表达差异的蛋白和基因,但明确功能的蛋白和基因尚不多,研究关键基因或蛋白的功能及调控机制有望为大白菜根肿病抗性研究提供新的思路。本课题组前期通过对
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大白菜根肿病是由芸薹根肿菌侵染植株的根系、并使其根部形成根瘤的一种病害。水及营养成分向植株地上部分运输受到阻碍,从而导致产量大幅度降低。近些年,根肿病抗病分子机制也已有一些报道,一些研究者已采用转录组分析、蛋白质谱分析、RNA-Seq技术等方法筛选出大量有表达差异的蛋白和基因,但明确功能的蛋白和基因尚不多,研究关键基因或蛋白的功能及调控机制有望为大白菜根肿病抗性研究提供新的思路。本课题组前期通过对根肿菌接种前后的大白菜根系进行差异转录组分析,筛选到一个接菌后在发病期显著上调表达的基因,在NCBI上查询其在大白菜上的基因功能注释为Brassica rapa cation/Ca2+exchanger 1,所以在大白菜中命名为Br CCX1。为进一步明确该基因的作用,本研究以大白菜根肿病感病’SN742’和抗病’SN205’为试验材料,分析了Br CCX1的时空表达;进行序列、生物信息学及表达位点分析;对Br CCX1基因在响应根肿菌侵染中的功能进行验证;通过酵母单杂试验筛选了上游转录因子及互作功能蛋白。得到如下结果:1.荧光定量分析发现在接菌后不同时期的抗病/感病大白菜根部,Br CCX1基因的表达量都发生了上调,感病材料’SN742’中上调尤为显著;对Br CCX1基因在感病材料的根、茎、叶的表达模式进行荧光定量分析,发现Br CCX1在接菌的根部上调表达显著。原位杂交结果显示,在接菌的感病材料的根部切片组织上呈现较强蓝色信号,与上述的荧光定量结果吻合。推测当Br CCX1在大白菜根肿病侵染过程中表达上调后,可能导致根肿菌侵染程度加重。综合以上结果表明Br CCX1在根肿菌对大白菜根部的侵染进程中有重要作用。2.克隆Br CCX1基因全长及其启动子序列,并进行生物信息学分析,结果发现在’SN205’材料中Br CCX1蛋白序列中发生一个由C（半胱氨酸）到R（精氨酸）的氨基酸变化,对应的蛋白结构也有差异;抗/感材料的启动子序列无差异。生物信息学结果表明Br CCX1有11个跨膜结构域,为跨膜蛋白,与PLN03151超家族蛋白(阳离子/Ca2+交换蛋白)同源性93.44%。构建含GFP的过表达载体p BWA（V）BS-Br CCX1-GFP进行亚细胞定位,结果显示目的基因在质膜处发散的荧光信号与膜Maker相结合。由此可见目的基因主要定位于质膜上。3.通过‘三引物法’筛选了纯合的同源拟南芥突变体ccx1,对纯合突变体和野生型（Wild Type）的子代根毛接种根肿菌,结果发现ccx1中根肿菌孢子侵染过程较WT中延缓;构建p TRV-Br CCX1载体,通过VIGS手段在大白菜中沉默Br CCX1,发现接种根肿菌后沉默植株的发病症状较对照中减轻,表明Br CCX1的沉默增强了大白菜对根肿病的抗性。4.以Br CCX1的启动子序列构建酵母单杂载体p Br CCX1-Ab Ai,在单杂文库中筛选找到了20个候选阳性克隆,一对一验证找到了9个互作蛋白,其中与TJLP1蛋白和转录因子MYB106的互作强度较强,推测MYB106能与Br CCX1的启动子结合在根肿菌侵染大白菜进程中来影响其表达量的水平变化,进一步起到相关的调控作用;Br CCX1可能在响应根肿菌侵染中与TJLP1结合,来调节信号以适应外界刺激。
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