背景:帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是世界上第二常见的神经系统变性疾病。研究发现,PD的发生与年龄密切相关,发病率在65岁以上老年人为1.7%,70岁以上老年人达到了3-5%。目前PD的临床诊断主要是根据病史、临床症状和体征及患者对多巴胺能药物的治疗反应。但因PD在疾病早期症状不典型,首发症状常为震颤、运动迟缓或肌强直,而这些临床症状出现时,事实上多巴胺能神经元变性缺失了50%-70%,这往往使患者错失了早期诊断、早期治疗的机会。且早期易与多系统萎缩、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性和路易体痴呆等疾病相混淆,误诊率较高。文献报道,PD的临床与病理诊断符合率仅为76%左右。因此探讨寻找一种有助于提髙早期PD临床诊断的正确率、且无侵入性和创伤性的生物标志物,对于早期有效治疗PD以及延缓疾病的进展,都具有非常重要的意义。近年来,PD生物标志物的研究主要集中在脑脊液和血浆/血清,但脑脊液的获取需行腰椎穿刺,有创,病人不易接受,使用受限。血浆/血清由于取样快速、简单、成本低和微创,适合作为生物标志物的来源。目前来源于血浆/血清的PD生物标志物主要是关于DJ-1、α-突触核蛋白和miRNA,但DJ-1、α-突触核蛋白的表达水平不同研究的结果间存在差异,甚至相互矛盾;并且其浓度与PD的严重程度无相关性。近十年研究发现miRNA敏感度和特异度较高,并且部分miRNA的表达水平与PD的严重程度相关,适合作为PD的生物标志物进行研究。microRNA(miRNA)是一种小的由21-24个核苷酸组成的单链非编码RNA。研究发现在人血清中存在各种miRNAs,且这种表达谱在机体的不同状态时呈现特定的变化。已有研究表明,与正常对照健康人相比,帕金森病人的血浆/血清中miRNAs表达谱明显不同。但是不同的研究得出的结果也有所不同,且稳定性和重复性均不足。推测除了采用的方法不同、研究对象不同、验证的样本数量不同外,更重要的是以下两方面的影响:1、血液中成分复杂,获取的miRNA种类与表达水平变化较快,干扰结果的稳定性;2、由于血脑屏障的存在,血液与大脑缺少直接的联系。直接用血液的检测结果不能客观真实的反映颅内疾病的状态。目前研究显示,mirna在体外主要有三种稳定存在的形式:1、与高密度脂蛋白结合,但这种情况具有高度细胞特异性,主要是存在于肝细胞中;2、与ago2蛋白结合,但这种形式尚无令人信服的研究证明其可介导功能mirna的转运,3、包裹于外泌体等膜囊泡中,这是近年研究的热点。外泌体是一种膜性小囊泡,直径约30-100nm,可由多种细胞在生理和病理条件下分泌,并存在于多种体液中。它通过转运蛋白质、脂质、dna、mrna和mirna等物质发挥功能。最近研究表明,外泌体由于其体积小,可透过血脑屏障从中枢神经系统转移至体循环,并且外泌体由于具备双膜结构能抵抗血液中核糖核酸酶的攻击,mirna不易降解,稳定性高。这提示血浆中外泌体所携带的mirna可能更真实地反映颅内情况,具备作为帕金森病早期诊断生物标志物的潜力。目的:筛选出pd患者血浆外泌体中特异的mirna表达谱,并进行靶基因预测及kegg通路分析,qrt-pcr验证,评价其对pd诊断的价值。方法:1、收集了51例散发性pd患者血浆和50例年龄/性别匹配的健康人血浆;2、用invitrogen试剂盒从血浆中分离外泌体,通过扫描电镜观察外泌体形态、qnano测定浓度及大小分布,westernblot检测外泌体标记蛋白cd63、alix的表达以对其进行鉴定;3、使用高通道测序检测两组血浆外泌体mirna的表达差异。4、使用mirna靶基因预测软件对差异表达的mirna进行靶基因预测,并对预测的靶基因进行kegg通路分析。5、采用使用taqman做探针的qrt-pcr技术验证初筛得到的12种差异显著的mirnas。结果:1、从血浆中分离得到mode直径<100nm、电镜下表现为由脂质双分子层包裹的圆形或杯口状囊泡、表达外泌体特异性标记蛋白cd63和alix的粒子,鉴定为外泌体。2、与对照组miRNA相比,PD组有66个miRNA表达明显差异(Ratio>2.0,P<0.05),其中27个表达上调,39个表达下调。3、预测到的与PD相关靶基因参与了ECM相互作用受体信号通路、神经因子营养通路、VEGF信号通路、TGF转化因子信号通路、白细胞跨内皮转移信号通路等信号通路。4、对初筛的表达差异显著的12种miRNAs进一步运用qRT-PCR技术验证。验证后发现有6种miRNAs(hsa-miR-195、hsa-miR-302e、hsa-mi R-15b hsa-miR-485-5p、hsa-miR-4483、hsa-miR-493-3p)在患者血浆外泌体中的表达与健康人血浆外泌体相比有显著差异;hsa-mi R-195、hsa-miR-302e显著上调,而hsa-miR-15b hsa-miR-485-5p、hsa-miR-4483、hsa-miR-493-3p显著下调。结论:1、本研究成功分离并鉴定了血浆外泌体。2、PD患者血浆外泌体中miRNA表达谱与正常人具有显著差异;我们发现PD患者血浆外泌体中mi RNA hsa-miR-195、hsa-mi R-302e显著上调,而hsa-miR-15b hsa-miR-485-5p、hsa-miR-4483、hsa-miR-493-3p显著下调;这6种miRNAs组合可能作为潜在的生物标志物进行PD诊断。