脑出血的临床和基础研究发现,一些细胞外基质(extracellular matrix,ECM)成分如基质金属蛋白酶(MMPs)、细胞纤维连接蛋白等的改变与脑出血的预后密切相关。透明质酸(hyaluronic acid or hyaluronan,HA)是细胞外基质的重要组分,由于其特殊的分子结构导致它在ECM中起到结构支撑和调节组织含水量的作用。HA通过其受体或结合蛋白,在细胞存活、增殖、迁移、炎性反应等方面发挥重要的作用。缺血性卒中的人体研究发现,患者外周血中寡聚的透明质酸(hyaluronan oligosaccharides,o-HA)在发病后14d内有明显的增高,同时透明质酸酶(hyaluronidase, Hyal)1的合成也明显增高；在脑组织缺血区神经元周围,透明质酸合成酶(hyaluronan synthase, HAS)的表达增加、HA的多种受体如CD44、HA介导的细胞游走受体(receptor of HA mediated motility, RHAMM)等的表达也明显增加,并且存在HAS2和RHAMM向内皮细胞、神经元的细胞核迁移的现象,这些结果提示：HA降解是卒中损伤急性期的一个特征,小分子HA的增加可能通过增强炎性反应加重组织损伤,但同时也可能通过其受体—细胞信号通路在调节神经和血管新生,乃至维持受损神经元的存活中发挥作用。我们推测,在脑出血后,HA分解产生小分子HA,其合成酶、分解酶、受体均会发生一系列改变,这种改变将对脑出血后水肿的形成、组织损伤及修复产生重要影响。因此,我们首次利用日本爱知医科大学先端医学医疗研究抛点自行研发的透明质酸合成酶1(HAS1)敲除(knock out, KO)小鼠制作自体血注射的脑出血模型,观察脑出血后小鼠神经功能和脑组织含水量的改变,研究脑出血后HA总量和不同分子量HA以及HA相关合成酶和分解酶的变化,并检测出血后炎性细胞因子的改变以及脑内细胞凋亡和／或坏死的情况,初步探索HA在脑出血组织损伤中的作用,为后续研究提供基础,并开辟脑出血后组织损伤和修复研究的新视角。第一部分HAS1敲除对脑出血后组织水肿和神经功能损伤的影响目的：探索一种物质的作用机制,首先应该明确这种物质的研究意义,在卒中的研究中,首先应该明确这种物质是否会影响卒中的预后。因此,我们第一部分就是观察HA的变化对脑出血的预后是否存在影响,如果存在影响,才值得我们进一步研究它的作用机制。方法：HAS1KO小鼠,制作自体血注射的脑出血模型,以野生型(Widetype,WT)鼠C57BL/6J为对照,研究HAS1敲除对脑出血小鼠神经功能和组织含水量的影响。WT和HAS1K0组(以下简称HAS1组),雄性,分2月龄、3月龄和9月龄3组,分别代表青年、壮年和老年鼠,每组至少6只小鼠,自体血25ul通过立体定向仪注入小鼠右侧尾状核,在出血后第3天观察神经功能改变,然后断头取脑,取右侧半球测量含水量。神经功能评分采用28分法(分数越高,神经缺损越严重)进行评价；含水量测量,取脑后测量湿重,使用真空冷冻抽干机抽干48h,然后放入烘箱中100℃,烘干24h,然后再测量干重。结果：(1)神经功能的改变：共71只小鼠(33只WT、38只HAS1小鼠)进行了行为学评价。WT组2月龄、3月龄和9月龄鼠的评分分别为4.7±3.0,4.3±1.8,7.1±4.5,同龄的HAS1组评分为7.8±4.6,7.7±4.2,10.8±2.8(同龄小鼠WT与HAS1组相比,均为p<0.05)。说明脑出血后第3d,HAS1组评分均高于WT组,即HAS1组神经缺损更严重。(2)含水量的改变：2月龄鼠,HAS1组与WT组的含水量无差异,但3月龄和9月龄鼠出血第3d的脑组织含水量均低于WT组,说明HAS1敲除会导致出血后脑组织的含水量下降。(3)将不同月龄小鼠综合进行相关性分析,发现两组小鼠神经功能均与含水量无关。结论：HAS1敲除导致脑出血后神经功能缺损更为严重,脑组织含水量较WT组下降。第二部分HAS1敲除对脑出血前后脑内HA、HA合成酶和分解酶的影响目的：第一部分的研究结果说明HAS1敲除导致脑出血后的神经缺损更为严重,而且这种变化并未伴随着含水量(即组织水肿)的恶化,那么这种变化的基础是什么?即HAS1敲除后,HA总量、不同分子量HA、HA的合成酶和分解酶是如何变化的?第二部分,我们检测HAS1敲除后,脑组织HA总量、大分子HA和小分子HA的变化、并使用real-time PCR方法检测HAS1、HAS2、HAS3、Hyal1、Hyal2、Hya13mRNA表达的变化。方法：WT组和HAS1组,分正常对照组、脑出血24h组、脑出血3d组,每组6只,ELISA方法测定出血侧半球HA总含量；然后,将每组6个样本,各取0.4ug(总量2.4ug),混合后,用葡聚糖凝胶层析的方法,分离不同分子量的HA,绘制洗脱管-HA浓度曲线,再用已知分子量的标准HA确定不同分子量HA的位置。最后以850KDa为界,分别计算大分子HA和小分子HA占总HA含量的百分比,比较WT与HAS1组的差异。同样分组的小鼠,每组6只,SYBR Green I进行real-time PCR,检测HAS1-3,透明质酸酶(Hyall-3) mRNA表达的变化。结果：(1)HA总量的变化：HAS1组脑内HA总量下降,仅为WT组的74%,下降1/4。脑出血后,WT组HA总量无明显变化,HAS1组HA总量下降,72h有显著改变。(2)不同分子量HA的变化：凝胶层析结果显示,正常情况下HAS1敲除小鼠脑内仍以大分子HA为主,但脑出血后,大分子HA含量相对下降,而小分子HA的含量相对增加,HAS1组这种变化更为明显。(3)HA合成酶和分解酶的改变：real-time PCR的结果显示,脑出血后,随时间的延长,WT和HAS1组HA合成酶和分解酶的mRNA表达均提高；出血后24h,HAS1组HAS3的表达更为明显。结论：HAS1敲除导致脑组织HA总量下降25%。脑出血后,由于HA分解酶的增加和HAS3为主的代偿反应,导致大分子HA含量减低,而小分子HA含量相对增加。第三部分：HAS1敲除对脑出血后细胞凋亡和／或坏死以及细胞因子的影响目的：综合前两部分的结果,我们已知HAS1敲除导致了脑组织HA总量的下降,以及脑出血后小分子HA的增加,这种改变伴随着神经功能缺损的加重,因此,第三部分我们将观察,脑出血后WT与HAS1组的细胞坏死和／或凋亡是否存在不同,而这种不同是否伴随着细胞因子表达的差异。方法：WT和HAS1组,分假手术组、脑出血24h组、脑出血72h组,每组5只小鼠,制作冰冻切片,进行Nissle染色、DAPI染色和TUNEL染色观察细胞坏死和凋亡情况,并通过Western blot检测Caspase-3活性片段(17KDa)的表达。利用RayBiotech蛋白芯片进行64种细胞因子的检测,比较两组之间的不同。结果：(1)Nissle染色、DAPI染色和TUNEL染色显示脑出血后HAS1组细胞坏死/凋亡更为明显,Caspase-3活性片段的表达也明显增加；(2)蛋白芯片结果显示,脑出血后HAS1组细胞因子表达明显增加,但是与WT组相比无明显差异。结论：HAS1组在脑出血后细胞凋亡和/或坏死更加严重,这可能与细胞因子表达的增加有关。总之,本研究发现,HAS1敲除将导致脑内HA总量的下降以及脑出血后小分子HA的增加,这些变化可能通过细胞因子表达的改变,导致出血后神经细胞发生更为严重的坏死和／或凋亡,从而导致神经功能缺损的加重。HAS1组脑出血后组织含水量下降的结果说明,水肿与脑出血后神经功能缺失无关。这些结果也提示,HA尤其是大分子HA在脑出血后早期的病变过程中,可能对脑组织具有保护作用,而小分子HA会加剧组织损伤。