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目的:探讨肝癌细胞中癌基因Pim-2及其可能的下游因子NF-κB与API-5三者之间的关系,初步明确肝癌细胞中Pim-2抗凋亡的信号通路,证实Pim-2可通过NF-κB通路激活API-5,从而抑制肝癌细胞凋亡、促进肝癌的发生发展。方法:(1)收集临床手术切除的肝细胞癌组织及相应癌旁组织各27例,以同期行非肿瘤性肝叶切除术的正常肝组织11例为对照,设置临床标本实验组共3组:肝细胞癌组织组、癌旁组织组和正常肝组织组(。2)通过Real-time PCR检测上述各组标本中Pim-2、NF-κB和API-5的mRNA水平;通过免疫组织化学和Western blotting分别检测上述各组标本中Pim-2、tAPI-5和pAPI-5的蛋白水平;通过EMSA检测上述各组标本中NF-κB的活性度。(3)构建携带人Pim-2基因的真核表达质粒,并将其转染入非肿瘤性人肝细胞L02细胞株,以未转染细胞及转染空载体的细胞为对照;设计针对Pim-2的特异性SiRNA,导入真核表达载体pGenesil-1,并将其转染入人肝癌细胞HepG2细胞株,以未转染细胞和转染空载体的细胞为对照(前期完成)。(4)设置细胞实验组共8组:非肿瘤性人肝细胞L02细胞组、转染Pim-2的L02细胞组、转染空载体的L02细胞组、人肝癌细胞HepG2细胞组、转染Pim-2 SiRNA的HepG2细胞组、转染空载体的HepG2细胞组、L02/Pim-2+银胶菊内酯(NF-κB信号通路特异性抑制剂)组、HepG2+银胶菊内酯组(。5)通过Real-time PCR检测上述各组细胞中Pim-2,NF-κB和API-5的mRNA水平;通过Western blotting检测上述各组细胞中Pim-2,tAPI-5和pAPI-5的蛋白水平;通过EMSA检测上述各组细胞核蛋白中NF-κB的活性度;通过AnnexinV-FITC/PI双染法检测上述各组细胞的凋亡率。结果:(1)临床标本实验发现:肝癌组织中Pim-2、NF-κB和API-5的mRNA水平较癌旁组织和正常肝组织中显著增高(p<0.05);肝癌组织中Pim-2、tAPI-5和pAPI-5蛋白呈阳性表达,而癌旁组织和正常肝组织中呈阴性表达;肝癌组织中Pim-2、tAPI-5和pAPI-5的蛋白水平较癌旁组织和正常肝组织中显著增高(p<0.05);肝癌组织中NF-κB活性度较癌旁组织和正常肝组织中显著增高(p<0.05)。(2)细胞实验发现:转染Pim-2的L02细胞中Pim-2的mRNA和蛋白水平较对照组显著增高(p<0.05);转染Pim-2 SiRNA的HepG2细胞中Pim-2的mRNA和蛋白水平较对照组显著降低(p<0.05)。在各实验组细胞中,NF-κB和API-5的mRNA水平随着Pim-2 mRNA水平的变化而平行变化;tAPI-5和pAPI-5的蛋白水平及NF-κB活性度也随着Pim-2蛋白水平的变化而平行变化。在高表达Pim-2的L02/Pim-2细胞和HepG2细胞中加入NF-κB特异性抑制剂银胶菊内酯后,Pim-2 mRNA及蛋白表达无显著变化,但其中NF-κB、API-5的mRNA水平,pAPI-5和tAPI-5的蛋白水平及NF-κB活性度均显著降低(p<0.05)。各实验组细胞凋亡率与Pim-2的表达水平无直接关系,而与pAPI-5的水平呈反向平行变化趋势。结论:(1)临床标本实验提示:Pim-2、NF-κB和API-5可能是与肝癌发生发展相关的某信号通路上的相关因子。(2)细胞实验进一步证实:Pim-2可通过磷酸化作用激活API-5从而抑制肝癌细胞凋亡,而NF-κB可能是该信号通路的关键调节因子。