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丙氨酸消旋酶(alanine racemase) (EC5.1.1.1)是以磷酸吡哆醛(pyridoxal 5’-phosphate, PLP)为辅酶,催化L型和D型丙氨酸之间转化的一种酶。丙氨酸消旋酶广泛分布在原核生物,在枯草杆菌B.subtilis,伤寒沙门氏菌Salm onella typhim urium,埃希氏菌属大肠杆菌Escherich ia coli,粪球链锁状菌Streptococcus faeca lis,假单胞杆菌Pseudomonas及分枝杆菌Mycobacterium等菌种中均有报道。其中,在伤寒沙门氏菌、埃希氏菌属大肠杆菌、假单孢杆菌、霍乱肠弧菌和枯草芽孢杆菌中均存在两种类型的丙氨酸消旋酶,分别命名为DadB (DadX)和Alr。DadB (DadX)是诱导型表达且参与L-丙氨酸的代谢,而Alr为组成型表达,参与D-丙氨酸的合成。本文以假单胞杆菌YZ-26(Pseudomonas putida YZ-26)基因组为模板,设计相应引物进行PCR,得到两种类型的丙氨酸消旋酶基因：Alr与dadX, Alr基因的开放阅读框为1230bp,编码410个氨基酸,预测分子量为44.2kDa, dadX基因的开放阅读框为1074bp,编码358个氨基酸,预测分子量为38.6kDa。序列比对结果显示,Alr的氨基酸序列与Pseudomonas putida KT2440的Alr相似性较高为94.4%,与Pseudomonas aeruginosa、Escherichia coli、Salmonella typhimurium的Alr的氨基酸相似性都比较低,分别为：27.3%、26.9%、27.4%。而DadX的氨基酸序列与Pseudomonas putida KT2440、Pseudomonas aeruginosa、Escherichia coli、Salmonella typhimurium的DadX比较,相似性分别为98.0%、71.1%、46.7%、45.2%。分别将上述两个消旋酶基因克隆到表达载体,构建重组质粒pETM-3c-Alr和pMAL-s-dadX,转入BL21(DE3)中经IPTG诱导后均为可溶性表达。经菌体破碎、Ni-Agarose亲和柱或Amylose亲和柱以及Sephacryl-S-200凝胶层析,获得电泳纯的Alr和融合麦芽糖结合蛋白MBP的MBP-dadX。活性测定表明：Alr不仅对丙氨酸具有消旋作用,而且对异亮氨酸也具有消旋作用,而MBP-dadX只对丙氨酸有消旋作用。对两类丙氨酸消旋酶Alr和MBP-dadX的酶学性质研究结果表明：Alr的Km和Vmax值分别为10.34 mmol/L、18.73μmol/min.mg,而MBP-dadX的Km和Vmax值分别为6.39mmol/L、8.83μmol/min.mg; Alr的最适pH为pH8.0,最适温度为37℃,在pH6.0到pH 12.0间以及4℃到40℃间酶稳定存在；MBP-dadX的最适pH为pH7.0,在pH6.0到pH10.0间酶稳定存在。和dadX相比,Alr有更好的碱性环境耐受性,二价金属离子对酶活性影响实验,揭示1mM的Sr2+、Mn2+、Co2+对两类酶均有激活作用,而Cu2+、Zn2+对丙氨酸消旋酶有较强抑制。Alr蛋白采用坐滴法,利用Hampton Research公司的Crystal ScreenⅠ&Ⅱ和PEG/ION试剂盒进行结晶条件的筛选、优化,确立蛋白浓度为4mg/ml,沉淀剂为25%PEG4000和0.2 M硫胺,缓冲液为0.1M的醋酸钠,pH4.8,温度16℃的条件是最佳结晶条件,最终获得长方形的单晶。在生物物理所平台室内光源(Rigaku R-Axis IV++)Cu靶Kαradiation(λ=1.5418 A))进行数据收集,衍射率达到2.4(?)。恶臭假单胞杆菌YZ-26丙氨酸消旋酶Alr晶体结构具有典型的a/p桶结构,为同源二聚体,2个单体首尾相接,由1个单体的N端结构域与另1个单体的C端结构域形成,通过一些极性和疏水力来维持其二聚体结构,单个亚基含有383个氨基酸,每个单体含有2个结构域,50～270个残基组成N端结构域,形成1个TIM桶结构,它是酶的活性位点区域,包括β2～β9的p折叠股、α1～α9的α螺旋；由247-381个氨基酸残基组成的C端结构域几乎完全由β折叠股组成。