CypA对结直肠癌生物学行为的影响和机制研究

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结直肠癌(Colorectal Carcinoma,CRC)是常见的消化系统恶性肿瘤。患者通常是以腹泻、腹痛、血便、下腹包块来就诊,此时已发展到该疾病的中晚期,往往患者生存质量较低,且预后大多较差。若能早期发现早期治疗,将对患者的预后有极大的改善。随着人们生活水平的提高,对于健康的追求也越来越高,所以急需找出一些新的、无创性的方法诊断、治疗癌症。近些年来,很多学者都在努力的寻找结直肠癌的生物标志物。亲环蛋白A(Cyclophilin A,CypA),最初被认为是一种胞内蛋白,具有催化和分子伴侣活性,在蛋白质折叠和运输方面发挥作用。随着研究的进一步深入,发现CypA蛋白在多种癌症中存在差异性表达,参与癌症的多种恶性生物学行为,但其在结直肠癌中发挥的作用尚不清楚。同时,其在结直肠癌发生发展的机制中所起的作用尚未得到证实。基于上述背景,我们提出以下问题:CypA在结直肠癌和癌旁组织中是否存在差异表达?对结直肠癌的恶性生物学行为有何影响?其在结直肠癌疾病发生发展的机制中所起的作用是什么?为了回答以上问题,本研究以结直肠癌为模型,CypA蛋白为核心,从临床患者组织水平,体外、体内细胞水平,蛋白分子水平开展以下研究:第一章CypA在结直肠癌组织中表达与临床意义查阅大量文献发现,CypA在多种癌组织中呈高表达,为了研究CypA是否在结直肠癌组织和癌旁组织中存在差异性表达,通过以下方法进行研究:1.利用在线数据分析工具,观察CypA基因在结肠、直肠癌和癌旁组织中的表达差异。结果发现:CypA基因在结、直肠癌组织中的表达量明显高于癌旁组织,具有明显统计学差异(p<0.01)。2.利用免疫印迹法(Western-Blot)检测8对配对的结直肠癌及癌旁组织中CypA蛋白的相对表达含量。结果发现,CypA在结直肠癌组织中表达高于癌旁组织(p<0.05)。3.应用酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定健康体检者(60例)和结直肠癌患者(70例)血清中CypA的表达水平。结果发现:在结直肠癌患者的血清中CypA的表达水平显著高于健康对照组,具有统计学差异(p<0.05)。4.采用免疫组织化学法观察135例结直肠癌患者术后的病理切片中CypA蛋白的表达,统计分析CypA蛋白的表达与临床和病理参数的相关性。结果发现:CypA蛋白在结直肠癌组织的表达水平高于癌旁组织;CypA的表达水平在结直肠癌TNM分期和周围淋巴结及血管浸润之间存在统计学差异(p<0.05)。CypA的表达水平在患者的性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤分化程度、肿瘤的直径之间无统计学差异(p>0.05)。通过以上研究我们得到以下结论:CypA在癌组织中高表达;CypA在结直肠癌患者血清中高表达;CypA表达水平与结直肠癌TNM分期和周围淋巴结及血管浸润存在正相关。第二章体外研究CypA对结直肠癌细胞HT29、SW620恶性生物学行为的影响前面实验证实了CypA在结直肠癌组织中高表达,为了研究CypA对结直肠癌细胞的恶性生物学行为是否存在影响,通过以下方法进行研究:1.利用Western-Blot方法检测CypA在正常结直肠粘膜细胞FHC和3种结直肠癌细胞的内源性表达。结果发现:CypA在结直肠癌细胞中呈高表达。2.采用分子克隆方法构建CypA质粒,设计CypA-siRNA,应用普通光学、荧光显微镜观察细胞形态。结果发现:转染CypA质粒后的细胞通过荧光显微镜观察到明显的绿色荧光。采用Western-Blot方法检测转染CypA质粒、CypA-siRNA后CypA蛋白表达含量。结果发现:转染CypA质粒后细胞内有GFP-CypA融合蛋白的表达,转染siRNA后细胞内CypA蛋白表达降低,可应用于后续实验。3.采用CCK8法检测肿瘤细胞的增殖能力。结果发现:CypA过表达后,细胞增殖能力明显增加(p<0.01);CypA沉默后,细胞增殖能力明显减低(p<0.01)。4.采用Transwell实验检测肿瘤细胞的迁移能力。结果发现:CypA过表达后,细胞迁移能力明显增加(p<0.01);CypA沉默后,细胞迁移能力明显减低(p<0.01)。5.采用Transwell实验检测肿瘤细胞的侵袭能力。结果发现:CypA过表达后,细胞侵袭能力明显增加(p<0.01);CypA沉默后,细胞侵袭能力明显减低(p<0.01)。通过以上研究我们得到以下结论:CypA促进结直肠癌细胞HT29、SW620增殖、迁移和侵袭等恶性生物学行为。第三章体内研究CypA对结直肠癌细胞HT29增殖的影响体外研究证实CypA过表达可以促进结直肠癌细胞HT29增殖,为了研究CypA在体内对结直肠癌细胞HT29增殖的影响,通过以下方法进行研究:1.将成功筛选的稳转细胞株pEGFP-N1和pEGFP-CypA经皮下注入到裸鼠体内(每组5只),每5天用游标卡尺测量皮下瘤体的大小,计算瘤体体积。25天后处死裸鼠,取出裸鼠体内瘤体,测量并称重。结果发现:与pEGFP-N1组比较,pEGFP-CypA组裸鼠移植瘤体积增大、重量增加(p<0.05);同时,观察裸鼠移植瘤生长曲线,与pEGFP-N1组比较,15天后,pEGFP-CypA组肿瘤显著大于对照组(p<0.01)。2.免疫印迹法验证裸鼠瘤体中GFP-CypA的表达。结果发现:在pEGFP-CypA组中,GFP-CypA蛋白持续表达。3.组织化学法测定裸鼠瘤体中CypA及增殖相关核抗原Ki67的表达。结果发现:与pEGFP-N1组对比,CypA在pEGFP-CypA组中表达更强,同时Ki67增殖指数在pEGFP-CypA组更高,即pEGFP-CypA组增殖更活跃。通过以上研究我们得到以下结论:CypA过表达促进结直肠癌细胞HT29增殖。第四章CypA调节结直肠癌细胞HT29、SW620增殖的机制体外、体内研究证实,CypA可以促进结直肠癌细胞的增殖,为了研究CypA对结直肠癌细胞HT29、SW620增殖机制,通过以下方法进行研究:1.选取10对TNM III期结直肠癌患者的癌组织及配对的癌旁组织,提取总蛋白、分析蛋白质浓度,制备蛋白水解多肽混合物,采用二维色谱-质谱联用技术法分离、鉴定多肽混合物。结果发现:在结直肠癌组织与癌旁组织差异表达的蛋白有28个,其中在结直肠癌组织表达显著上调的有20个,下调的有8个。2.对结直肠癌中差异蛋白进行IPA(Ingenuity Pathway Analysis)分析。结果发现:差异蛋白与细胞运动、增殖、侵袭、迁移等方面的功能相关;结直肠癌增殖功能中密切相关的ERK/MAPK通路可能被激活。3.我们将二维色谱-质谱联用技术筛选出来的差异蛋白CypA,与IPA分析中发现的增殖功能相关的ERK/MAPK通路中相关蛋白,进行免疫印迹分析。结果发现:CypA过表达后CD147蛋白表达量增加(p<0.05),p-ERK1/2蛋白表达量增加(p<0.05),p-ERK1/2与ERK1/2的表达量的比值增加(p<0.05)。CypA沉默后CD147蛋白表达量明显减少(p<0.01),p-ERK1/2蛋白表达量明显降低(p<0.01),p-ERK1/2与ERK1/2的表达量的比值明显降低(p<0.01)。CypA过表达和沉默后,ERK1/2蛋白表达变化不明显(p>0.05)。CypA过表达和沉默后,p-p38蛋白、p38蛋白表达变化不明显(p>0.05)。通过以上研究我们得到以下结论:CypA通过调节ERK/MAPK通路,促进结直肠癌细胞HT29、SW620增殖。我们通过以上实验,得出以下结论:1.CypA在结直肠癌组织和结直肠癌患者的血清中高表达,CypA表达水平与结直肠癌TNM分期和周围淋巴结及血管浸润存在正相关。2.CypA促进结直肠癌细胞HT29、SW620增殖、迁移和侵袭等恶性生物学行为。3.CypA通过ERK/MAPK信号传导通路促进结直肠癌细胞HT29、SW620增殖。
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