在上世纪八十年代，科学家们发现神经系统有合成甾体的能力。进而提出了神经活性甾体的概念。神经活性甾体(neuroactivesteroids，NASs)是天然存在或者人工合成的在神经组织具有活性的所有甾体激素的统称。神经活性甾体对神经系统的功能活动有着广泛的调节作用。神经活性甾体与神经元兴奋毒性死亡、凋亡有着密切的关系，并对学习记忆有着重要的影响。 随着社会的老龄化，阿尔茨海默氏病(Alzheimer'sDisease，AD)、帕金森氏病(Parkinson’sDisease，PD)、脑缺血等疾病的发病率呈上升趋势，这类疾病严重威胁着人们的生命健康并往往伴随着神经元的丧失和学习记忆能力的下降。目前，这类疾病尚没有理想的治疗方法。实验表明体内某些甾体激素的水平与此类疾病的发生发展有关。神经活性甾体的替代疗法已运用于临床，如雌激素用于AD的治疗。但是这些甾体的副作用问题也比较突出。因此，深入研究神经元凋亡的机制，并寻找作用特异、保护效果好、副作用小的甾体药物是努力的方向之一。 海洋甾体(又称甾醇类化合物)是来源于海洋生物体内的一大类重要的天然化学成分，它们许多独特的结构是在陆生物体内所不曾发现的。迄今为止对海洋甾体的研究重点涉及其溶血、抗炎、细胞毒和抗肿瘤、抗菌、抗真菌、抗病毒等药理特性。本实验室的前期研究表明，从南沙群岛唇软珊瑚中提取的四羟基甾醇(氧代固醇)类化合物YC-1能够抑制低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡，这是首次报道海洋甾体具有神经保护作用。然而，由于YC-1目前只能从南沙群岛唇软珊瑚等少数海洋生物中提取得到，采集不易和越来越严格的海洋环境保护使其来源十分有限，而且YC-1在这些生物体内的含量极微，加上提取步骤烦琐低效，造成天然品YC-1的纯度有限、成本相当昂贵，难以实现工业化生产，大大阻碍了对YC-1药理学机制的深入研究。目前，本实验室以廉价的猪去氧胆酸为原料，通过化学合成的方法得到了YC-1及其类似物YC-2。 本文主要是探讨化学合成的海洋甾体YC-1和YC-2在细胞模型和动物模型上的神经保护作用，并探讨了它们的作用机制，希望能为海洋甾体作用机制的阐明和防治中枢神经系统损伤的新药开发提供线索和帮助。 第1章海洋甾体YC-1和YC-2对低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的抑制作用及机制 低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡模型是最为常用的凋亡模型。我们在实验中发现，化学合成的海洋甾体YC-1和YC-2对低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡有明显的抑制作用，进而从信号转导的角度探讨了P13K/Akt通路及MAPK家族成员在YC-1和YC-2抑制小脑颗粒神经元凋亡中的作用。 方法:大鼠小脑颗粒神经元的分离和原代培养；相差显微镜术(phasecontrastmicroscopy)观察神经元的胞体及突起形态；Hoechst33258染色观察神经元核及染色质的形态变化；琼脂糖凝胶电泳(agarosegelelectrophoresis)及溴化乙锭(ethidiumbromide，EB)染色观察神经元DNA的降解特性；二乙酸荧光素(fluoresceindiacetate，FDA)染色检测神经元的代谢活性(metabolicactivity)和存活率(viability)；Westernblotting蛋白免疫印迹法分别检测Akt、ERK1/2、c-Jun蛋白以及它们各自的磷酸化水平；逆转录.聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR)观察c-jun基因的表达水平；westernblotting并检测凋亡过程中c-Jun上游激酶JNK、p38的活性的变化，探讨c-Jun的在低钾诱导小脑颗粒神经元凋亡中的激活机制；定量实验结果以-x±s表示，采用t检验和方差分析。 结果:FDA活细胞染色、Hoechst33258核染色、琼脂糖凝胶DNA电泳表明10μM/L的YC-1和YC-2能够抑制低钾诱导的小脑颗粒神经元的凋亡。YC-1、YC-2对低钾过程中Akt、ERK的活性无影响；即早基因c-jun在YC-1、YC-2抑制低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡过程中被下调，c-Jun蛋白亦被下调且活性明显降低，其上游激酶JNK活性保持不变，但p38活性被下调。 结论:化学合成的海洋甾体YC-1和YC-2能够抑制低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡，这一作用是通过抑制低钾过程中c-jun基因的转录和表达及抑制p38/c-Jun通路来实现的。 第2章海洋甾体YC-1和YC-2对缺氧/再给氧诱导小脑颗粒神经元凋亡的抑制作用及机制 本章建立了缺氧/再给氧(H/R)诱导小脑颗粒神经元凋亡的模型，进而从信号转导的角度探讨了P13K/Akt通路及MAPK家族成员在缺氧/再给氧诱导小脑颗粒神经元凋亡中的作用；观察海洋甾体YC-1、YC-2对缺氧/再给氧诱导小脑颗粒神经元凋亡的影响，并对其机制进行探讨。 方法:小脑颗粒神经元的分离培养及凋亡检测同第一章；westernblotting蛋白免疫印迹法分别检测Akt、ERK1/2、JNK、p38的活性的变化。新鲜分离海马神经元；应用膜片钳测定海洋甾体YC-1对谷氨酸引起的内向电流的影响；应用激光共聚焦显微镜测定海洋甾体YC-1对谷氨酸引起的钙内流的影响。 结果:FDA活细胞染色、Hoechst33258核染色表明缺氧3小时再给氧24小时能够诱导小脑颗粒神经元凋亡；但琼脂糖凝胶DNA电泳和流式细胞仪凋亡峰分析均未发现DNA断裂；在缺氧/再给氧诱导小脑颗粒神经元凋亡的过程中，Akt的活性被抑制；ERK的活性不受影响；p38在缺氧时被激活；JNK的活性随着再给氧时间的延长活性逐渐增强。化学合成的海洋甾体YC-1和YC-2对缺氧/再给氧诱导的小脑颗粒神经元凋亡有明显的抑制作用；YC-1、YC-2对缺氧/再给氧过程中Akt、JNK、p38的活性均无影响。在新鲜分离的海马神经元上，YC-1预处理30分钟能够明显减少谷氨酸引起的内向电流；YC-1预处理30分钟能够抑制谷氨酸引起细胞内钙离子浓度的升高。 结论:缺氧3小时再给氧24小时能够导致小脑颗粒神经元死亡，这一死亡主要是凋亡；该凋亡模型不表现DNA的断裂。缺氧/再给氧诱导小脑颗粒神经元凋亡过程中伴随着Akt活性的降低和JNK、p38活性的增强。化学合成的海洋甾体YC-1和YC-2能够抑制缺氧/再给氧诱导的小脑颗粒神经元凋亡，这一作用不足通过激活P13K/Akt通路、抑制JNK和p38的活化来实现的。YC-1能够抑制谷氨酸引起的钙内流增加。 第3章应用基因芯片技术研究海洋甾体YC-1抑制缺氧诱导小脑颗粒神经元凋亡的差异表达基因谱 本实验应用大鼠表达谱基因芯片筛选出正常培养的大鼠小脑颗粒神经元(N)与缺氧3小时的小脑颗粒神经元(H)、提前1小时给予10μMYC-1并缺氧3小时的小脑颗粒神经元(YC-1)与缺氧3小时的小脑颗粒神经元(H)的差异表达基因谱，研究海洋甾体YC-1抑制缺氧诱导的小脑颗粒神经元凋亡过程中的差异表达基因，初步探讨海洋甾体YC-1抑制缺氧诱导小脑颗粒神经元凋亡在基因水平的机制。 方法:小脑颗粒神经元的分离培养同第一章；应用含有31，042条基因的大鼠表达谱基因芯片，用生物素标记探针，检测正常培养的大鼠小脑颗粒神经元、缺氧3小时的小脑颗粒神经元、提前1小时给予10μMYC-1并缺氧3小时的小脑颗粒神经元的基因表达情况。 第4章化学合成的海洋甾体YC-1对局灶性脑缺血的保护作用 在第1章和第2章中我们分别在低钾诱导小脑颗粒神经元凋亡模型和缺氧/再给氧诱导小脑颗粒神经元凋亡模型中观察了化学合成的海洋甾体YC-1和YC-2的保护作用，本章主要观察化学合成的海洋甾体YC-1对大鼠大脑中动脉栓塞致局灶性脑缺血的保护作用。 方法:SD大鼠大脑中动脉栓塞(middlecerebralarteryobstruction，MCAO)法制作局灶性脑缺血动物模型；行为学评分、TTC染色观察YC-1的保护作用。 结果:YC-1能够减轻MCAO大鼠的行为学异常；YC-1能够减少MCAO引起的大脑局灶性脑缺血体积。 结论:化学合成的海洋甾体YC-1对MCAO致大鼠局灶性脑缺血具有保护作用。 第5章海洋甾体YC-1脂质体LD50的测定及对大鼠局灶性脑缺血的保护作用本章主要研究YC-1剂型改造后的半数致夕匕量和其对大鼠大脑中动脉栓塞致局灶性脑缺血的保护作用。 方法:YC-1脂质体的半数致死量的测定；SD大鼠大脑中动脉栓塞(middlecerebralarteryobstruction，MCAO)法制作局灶性脑缺血动物模型、行为学评分、TTC染色同第3章。