目的:恶性淋巴瘤是儿童期最常见的恶性肿瘤之一,发病率呈上升趋势,非霍奇金淋巴瘤(NHL)大约占淋巴瘤总数的80%～90%,是淋巴瘤最常见的类型。NHL通常采用传统化疗,尽管化疗效果较好,但原发耐药和反复复发往往是影响患儿长期生存的主要原因。因此,有必要寻找一种更为有效的治疗措施。缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor 1 alpha,HIF-1α)是一个在缺氧状态下重要的转录调节因子,控制调节各种由缺氧引起的相关基因表达,参与肿瘤的恶化、浸润和转移,在肿瘤领域已成为研究热点。目前认为HIF-1α在肿瘤的发生中有重要作用,HIF-1α的表达与肿瘤的生长和血管生成紧密相关,抑制HIF-1α活性可能是治疗癌症的一种途径。体外研究表明,靶向HIF-1α的反义技术能够抑制肿瘤细胞生长并增加细胞对化疗药物的敏感性。西罗莫司(Sirolimus)是一种大环内酯抗生素类免疫抑制剂,近年来发现西罗莫司有抗肿瘤作用,其抗肿瘤作用很可能与西罗莫司可有效抑制HIF-1α蛋白的表达有关,但具体机制未完全阐明。本实验通过检测HIF-1α和血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelia cell growth factor,VEGF)在儿童NHL组织中的表达情况,探讨HIF-1α及VEGF在儿童NHL发病机制中的作用;并体外培养人非霍奇金淋巴瘤Raji细胞,观察西罗莫司对Raji细胞增殖、凋亡及细胞周期分布的影响,并检测HIF-1α在细胞中的表达情况,探讨西罗莫司对恶性淋巴瘤细胞的作用及其抗肿瘤的可能机制;在此基础上体外研究西罗莫司联合阿霉素(Adriamycin,ADM)对Raji细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其作用机制,为西罗莫司的临床应用提供理论依据。方法:1选取河北医大第四医院病理科2004年3月至2008年9月活检及手术切除儿童NHL标本30例,其中T细胞型13例,B细胞型17例,根据St.Jude非霍奇金淋巴瘤分期系统,将以上病例分为低度危险组11例为Ⅰ、Ⅱ期,高度危险组19例为Ⅲ、Ⅳ期。另取10例反应性增生淋巴结作为对照组。采用免疫组织化学S-P法检测各组中HIF-1α和VEGF的表达情况,并分析两者表达的相关性。2体外培养人非霍奇金淋巴瘤Raji细胞,用不同浓度的西罗莫司和阿霉素进行干预。应用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞生长情况,并计算半数生长抑制剂量(IC50)。根据IC50选择药物的作用浓度及作用时间。3把Raji细胞分为对照组:细胞培养基中加入与实验组等体积的二甲基亚砜(DMSO);西罗莫司组:细胞培养基中加入DMSO溶解的西罗莫司,终浓度分别为5,10,15,20ng·mL-1;阿霉素组:细胞培养基中加入PBS溶解的阿霉素,终浓度为10mg·L-1;西罗莫司+阿霉素组:西罗莫司终浓度为10ng·mL-1,阿霉素终浓度为10mg·L-1。应用MTT比色法检测细胞生长情况,流式细胞术(FCM)分析各组中细胞凋亡及细胞周期分布的情况;同时应用FCM和免疫细胞化学染色法检测HIF-1α蛋白在西罗莫司各组中的表达情况。结果:1 HIF-1α在对照组、低度危险组和高度危险组的阳性表达率分别为0.00%、54.55%、73.68%,三组比较差异有统计学意义(P<0.05)。VEGF在三组中的阳性表达率分别为0.00%、63.64%、84.21%,三组比较差异有统计学意义(P<0.05)。2HIF-1α在T、B细胞型儿童NHL组织中的阳性表达率分别为61.54%、70.59%,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。VEGF在两组中的阳性表达率分别为69.23%、82.35%,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。3 Spearman等级相关分析显示:HIF-1α和VEGF在儿童NHL组织中的表达呈正相关(r=0.671,P<0.05)。4 MTT比色试验结果显示:PBS及终浓度0.1%的DMSO在实验中对Raji细胞生长没有明显影响;西罗莫司和阿霉素对Raji细胞的抑制作用在一定范围内呈时间剂量依赖性;药物作用48h后阿霉素的IC50为11.47mg·L-1,西罗莫司的IC50为17.19ng·mL-1。5 MTT比色试验结果表明:西罗莫司各浓度组作用于Raji细胞48h后抑制率分别为25.99%、34.28%、53.08%、56.40%;阿霉素作用于Raji细胞48h后抑制率为47.47%;西罗莫司+阿霉素组作用于Raji细胞48h后抑制率为65.98%。西罗莫司各浓度组作用于Raji细胞48h后吸光度值与对照组相比均有显著性差异(P<0.05);15,20ng·mL-1浓度组之间无显著性差异(P>0.05),其余各组之间均有显著性差异(P<0.05)。各实验组作用于Raji细胞48h后西罗莫司+阿霉素组吸光度值为( 0.431±0.047 ),与单独应用同浓度西罗莫司组(0.832±0.071)和阿霉素组(0.601±0.041)相比均有显著性差异(P<0.05)。6流式细胞术检测结果显示:西罗莫司各浓度组作用于Raji细胞48h后凋亡率分别为(7.60±1.02)%、(11.32±0.95)%、(23.17±1.95)%、(32.20±1.80)%;对照组凋亡率为(2.29±0.31)%。用最小显著差法两两比较,各实验组与对照组相比均具有显著差异(P<0.05)。经单因素方差分析,各浓度组间西罗莫司对细胞凋亡率的影响有显著差异(P<0.05)。阿霉素作用于Raji细胞48h后凋亡率为(0.93±0.17)%,与对照组相比无显著差异(P>0.05)。西罗莫司+阿霉素组作用于Raji细胞48h后凋亡率为(10.63±0.94)%;与对照组、阿霉素组相比均具有显著差异(P<0.05),与同浓度西罗莫司组相比无显著差异(P>0.05)。7流式细胞术检测结果显示:西罗莫司各浓度组作用于Raji细胞48h后G0/G1期细胞比例分别为(57.27±1.16)%、(62.07±1.79)%、(68.67±0.06)%、(72.57±0.85)%;S期细胞比例分别为(29.67±1.00)%、(27.33±0.87)%、(21.87±0.42)%、(18.87±1.56)%;G2/M期细胞比例分别为(13.07±0.25)%、(10.63±0.88)%、(9.48±0.38)%、(8.56±0.75)%。对照组处于G0/G1期,S期,G2/M期细胞比例分别为(39.97±0.74)%、(45.03±0.93)%、(15.00±0.92)%。与对照组相比,西罗莫司各浓度组细胞周期分布发生明显变化(P<0.05)。经单因素方差分析,各浓度组间西罗莫司对细胞周期的影响有显著差异(P<0.05)。阿霉素作用于Raji细胞48h后处于G0/G1期,S期,G2/M期细胞比例分别为(32.13±0.76)%、(46.40±0.72)%、(21.50±1.32)%。与对照组相比,细胞周期分布无明显变化(P>0.05)。西罗莫司+阿霉素组作用于Raji细胞48h后G0/G1期细胞比例为(53.57±1.10)%;S期细胞比例为(32.67±1.17)%;G2/M期细胞比例为(13.77±0.15)%。与对照组、阿霉素组相比,细胞周期分布发生明显变化(P<0.05),与同浓度西罗莫司组相比无显著差异(P>0.05)。8流式细胞术检测结果显示:西罗莫司各浓度组作用于Raji细胞48h后HIF-1α蛋白表达定量分析FI分别为0.91±0.015,0.78±0.021,0.64±0.025,0.57±0.026。对照组HIF-1α蛋白表达FI被看作为1,西罗莫司各浓度组HIF-1α蛋白表达率与对照组相比差异有显著意义(P<0.05)。西罗莫司各浓度组HIF-1α蛋白表达下降。9免疫细胞化学染色法结果显示:HIF-1α蛋白阳性表达位于细胞核和细胞浆,呈淡黄色至棕黄色颗粒状,在相同光学条件下根据染色深浅判断各组间的变化。经西罗莫司作用后细胞胞核胞浆染色较对照组浅,颗粒减少,说明加入西罗莫司后,HIF-1α蛋白表达降低。结论:1儿童NHL组织中存在HIF-1α和VEGF高表达情况,且HIF-1α和VEGF在儿童NHL组织中的表达呈正相关;HIF-1α→VEGF途径可能参与儿童NHL的发病。2西罗莫司体外对Raji细胞生长具有明显的抑制作用,且在一定范围内呈时间、剂量依赖性。3西罗莫司使Raji细胞G0/G1期细胞数增多,S期和G2/M期细胞数减少,通过阻滞细胞周期于G0/G1期,抑制Raji细胞的增殖。此可能是西罗莫司抗肿瘤的作用机制之一。4西罗莫司体外可抑制Raji细胞中HIF-1α蛋白的表达,并呈剂量依赖关系。认为西罗莫司诱导Raji细胞凋亡的作用部分是通过下调HIF-1α蛋白的表达来实现的,这可能是西罗莫司抗肿瘤的另一作用机制。5西罗莫司与阿霉素联合用药对Raji细胞生长具有明显的抑制作用,且优于单独应用西罗莫司或阿霉素。但二者联合应用对Raji细胞凋亡和细胞周期的影响与单独应用西罗莫司无显著差异。这可能与阿霉素为细胞周期非特异性药物,细胞毒作用可发生于各期细胞有关。