一、研究背景支气管哮喘(Bronchial asthma, asthma)是一种多细胞因子参与调节,以嗜酸性粒细胞浸润为主的多种细胞(包括炎症细胞及结构细胞)参与的慢性气道炎症性疾病。哮喘在全球范围内均是常见的慢性呼吸道疾病,且患病率呈逐年增长趋势。哮喘具有以下三大特征：慢性气道炎症、气道重塑和气道高反应性(Airway hyperresponsiveness,AHR),其中气道重塑正日益成为人们研究的重点及热点,这种重塑涉及气道各层组织,包括气道壁增厚和基质沉积,上皮下纤维化,平滑肌增生和肥大,肌成纤维细胞增殖及黏液腺、杯状细胞化生及增生,上皮下网状层增厚,微血管生成等。目前研究认为气道炎症与气道高反应性、气道重塑密切相关,炎症、损伤、修复和重塑是一个不断进展的病理过程,最终导致气道壁增厚,促使气道狭窄和气流受限,并可形成顽固性哮喘。近年来在哮喘方面的研究发现,哮喘患者气道壁中存在着细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)过度沉积,且与非哮喘患者相比,ECM蛋白的成分及构成比例均发生了较大的变化。ECM是指由细胞分泌到细胞外间质中的大分子物质所构成的复杂网络结构,主要成分有胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖和糖蛋白,起着支持并连接组织结构、调节细胞生理活动的作用。此外,ECM还具有影响细胞分化、增殖、粘附、形态发生和表型表达的作用。既往观点认为,气道平滑肌细胞(Airway smooth muscle cell, ASMC)作为一种被动的结构细胞,仅在炎症介质的刺激下发挥调控气道舒缩的功能,相关研究亦多着眼于炎症介质或神经递质对气道平滑肌的收缩作用以及内源性或外源性支气管舒张物质对支气管平滑肌的松弛作用。但新近研究证据表明,ASMC还能发生表型转化,合成分泌多种细胞因子、趋化因子、生长因子、粘附因子及ECM,主动参与哮喘气道炎症发生、发展的全过程,进而加重气道重塑和AHR。体外实验亦证实人气道平滑肌细胞(Human airway smooth muscle cell, HASMC)可分泌包括Ⅰ型胶原蛋白(Type1collagen, COL-Ⅰ)、纤维粘连蛋白(FN)在内的多种ECM蛋白,且ECM蛋白可影响体外HASMC的增殖和迁移。因此,有学者提出应把ASMC作为哮喘研究的新靶点,通过对其表型转化和合成、分泌作用的深入研究,以期为哮喘的治疗提供新方法。由于哮喘患者的ASMC难以获得,国内外研究均以哮喘血清被动致敏HASMC。且国外研究证实,体外培养的被动致敏HASMC与正常人血清处理相比,其所分泌的ECM蛋白成分及含量均明显不同。因此,以哮喘血清被动致敏HASMC进行研究有助于了解ASMC在哮喘疾病进展中的作用和地位。细胞外信号调节激酶(Extracellular signalregulated kinase, ERK)信号通路是细胞内重要的信号转导通路,参与了哮喘气道慢性炎症、AHR和气道平滑肌的增殖等多种病理生理过程。目前国内主要在哮喘动物模型基础上对ERK信号通路在平滑肌细胞增殖、迁移等方面进行研究。XIE Shao-ping等在体外培养HASMC上的实验表明,抑制ERK信号通路可抑制转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的结缔组织生长因子(CTGF) mRNA、蛋白表达及CTGF下游信号转导通路Smad2/3的磷酸化。Johnson等研究表明,哮喘ASMC和非哮喘ASMC均呈ERK依耐性表达COL-I和FN, ERK信号通路参与了CTGF刺激HASMC分泌ECM蛋白的过程。综上所述,我们推测ERK信号通路在HASMC分泌ECM蛋白中起着重要的作用。肾素-血管紧张素系统(Rennin-angiotensin system, RAS)作为经典的循环激素系统,经过50余年的研究,被证实不仅是一种循环激素,更是一种组织和局部激素,广泛存在于心、脑、肝、肾、血管、脂肪、骨髓、生殖和胚胎等器官或组织中,发挥自分泌、旁分泌和局部激素作用,除参与各种心血管和肾脏疾病的发生发展外,还与肺疾病转归及预后有关。血管紧张素Ⅱ (Angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)作为RAS中的重要效应物质,除具调节血管张力、血流及促进细胞生长、增殖等作用外,尚有致炎作用,通过与细胞膜上的特异性受体结合而发挥调节细胞因子、趋化因子和黏附分子等多种炎症介质表达的作用,参与机体炎症相关疾病的发生和发展。现已发现血管紧张素Ⅱ1型受体(Angiotensin Ⅱ type1receptor, AT1R)、血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)、血管紧张素Ⅱ3型受体(AT3R)、血管紧张素Ⅱ4型受体(AT4R)四种Ang Ⅱ受体亚型,在人及啮齿类动物中以AT1R和AT2R为主。近年来,大量研究表明Ang Ⅱ主要是通过与AT1R结合,从而发挥其经典作用。除心、肾、脑、血管等组织器官外,有学者在肺组织中也检测到了AT1R。在心、肝、肾纤维化方面的大量研究表明,AngⅡ可促进包括肾小球系膜细胞、心肌细胞、血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell, VSMC)在内的多种细胞分泌多种ECM蛋白(胶原蛋白、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、透明质酸等),参与组织重塑,且这一作用可为AT1受体阻滞剂所阻断。胶原蛋白(简称胶原)是ECM的主要结构蛋白,COL-I是含量最高的胶原类型,也是正常及病变气道壁主要的ECM蛋白。Carol[22]等采用[3H]-脯氨酸掺入释放法,检测到AngⅡ (10-7mol/L)刺激下VSMC胶原合成明显增多,而在10倍于AngⅡ浓度的AT1R拮抗剂洛沙坦干预后胶原合成量则明显减少。刘翠丽等通过大鼠体内试验证实,哮喘大鼠肺组织局部存在RAS活化,增多的AngⅡ促进ASM增殖肥大和气道壁胶原沉积增加,AT1R拮抗剂厄贝沙坦干预可以减轻气道重塑的发生,并对肺功能有一定的改善作用。综合上述实验结果,我们推测AngⅡ可能通过与ASMC膜上的AT1R结合促进被动致敏的HASMC分泌COL-Ⅰ,ERK1/2信号转导途径可能是其下游通路。富含COL-I等ECM组分的细胞培养上清可能对HASMC增殖具有促进作用。二、研究目的通过采血并分离哮喘急性发作期患者血清,被动致敏体外培养的HASMCs,模拟哮喘ASMC,并以AngⅡ、AT1R拮抗剂洛沙坦及ERKl/2信号通路抑制剂PD98059处理被动致敏后的HASMCs,以仅加哮喘血清组作为对照,初步研究AngⅡ对被动致敏的HASMCs分泌COL-I的影响及其可能机制,并用上述细胞培养上清刺激HASMCs,初步了解COL-I含量不同的细胞培养上清对HASMCs增殖的影响,以期为哮喘气道重塑的防治提供新的靶点。三、材料和方法1.人气道平滑肌细胞(HASMC)的分离培养与鉴定：无菌状态下,取我院胸外科肺肿瘤患者肺叶切除术后肿瘤旁远端正常支气管组织。按照相关文献报道和本课题小组已经成熟的方法,采用组织块贴壁培养法进行原代HASMC的培养,采用自然及人工方法纯化细胞。在倒置显微镜下观察细胞生长及形态,并用抗平滑肌a-肌动蛋白(a-SM actin)抗体行免疫荧光细胞染色鉴定为HASMC。取3-5代细胞用于实验。2.实验分组：将实验细胞分为以下6组：①：哮喘血清被动致敏组：加入含10%哮喘血清的DMEM;②被动致敏+Ang Ⅱ组：含10%哮喘血清的DMEM+Ang Ⅱ(终浓度为10-7mol/l)；③被动致敏+Losartan组：含10%哮喘血清的DMEM+Losartan (终浓度为10-6mol/l);④被动致敏+Ang Ⅱ+Lostarn组：含10%哮喘血清的DMEM+AngⅡ(终浓度为10-7mol/l)+Losartan(终浓度为10-6mol/l);⑤被动致敏+PD98059组：含10%哮喘血清的DMEM+PD98059(终浓度为10-5mol/l)⑥被动致敏+Ang Ⅱ+PD98059组：含10%哮喘血清的DMEM+Ang Ⅱ(终浓度为10-7mol/l)+PD98059(终浓度为10-5mol/l)。3.天狼猩红苦味酸染色观察HASMC是否表达胶原蛋白。4.实时荧光定量PCR法检测COL-ImRNA表达情况。5.酶联免疫吸附法检测细胞培养上清中COL-Ⅰ蛋白的浓度情况。6.MTT法检测细胞培养上清对HASMC是否有促增殖作用。7.实验所得原始数据以均数±标准差(X±s)表示,利用SPSS13.0统计分析软件,多组间均数比较采用单因素方差分析,P<0.05表示差异有统计学意义。四、结果1.倒置显微镜在X100倍镜下观察,HASMCs未汇合之前多呈长梭形或多边形,细胞汇合后部分区域的细胞成束状排列,呈现起伏状生长,呈典型“峰与谷”状,对平滑肌细胞特异的a-肌动蛋白(aSM-actin)进行免疫荧光细胞染色,在x200高倍镜下可见aSM-actin在气道平滑肌细胞胞浆内均匀分布,呈绿色荧光。传至第3-4代,平滑肌细胞纯度为95%。2.苦味酸天狼猩红染色胶原蛋白分子富含碱性氨基酸,可与酸性染料起强烈反应。天狼猩红(Sirius red)为一种强酸性染料,能与胶原蛋白强力结合。普通光镜下,天狼猩红染色胶原蛋白呈红色。细胞爬片染色后,普通光镜下观察见HASMC胞浆呈红色。3.AngⅡ对被动致敏HASMC COL-ImRNA表达的影响实时荧光定量PCR结果显示,AngⅡ(10-7mol/l)可促进被动致敏HASMCs COL-ImRNA表达,与对照组相比增殖幅度达1.63±0.96倍(P<0.01)。在血管紧张素AT1R特异性阻断剂洛沙坦(Losartan)存在的情况下,AngⅡ对被动致敏HASMCs COLImRNA表达的促进作用降至1.02±0.61倍(P<0.01)。ERKl/2信号通路拮抗剂PD98059预处理30min后,AngⅡ诱导HASMCs分泌的COLI蛋白浓度降至1.17±0.46倍(P<0.01)。4. AngⅡ对被动致敏HASMC COLI的促分泌作用Elisa结果显示,AngⅡ (10-7mol/l)可促进被动致敏HASMCs分泌COLI蛋白,浓度可达86.94±6.25ng/ml (P<0.01)。在血管紧张素AT1受体特异性阻断剂洛沙坦(ARB)存在的情况下,AngⅡ处理后HASMCs分泌的COLI蛋白浓度降至55.55±3.29ng/ml (P<0.01)。ERK1/2信号通路拮抗剂PD98059预处理30min后,AngⅡ诱导HASMCs分泌的COLI蛋白浓度降至55.92±5.19ng/ml (P <0.01)。5.细胞培养上清对HASMCs增殖的影响。MTT结果显示,与对照的单纯哮喘血清刺激组细胞培养上清相比较,AngⅡ (10-7mol/l)+哮喘血清刺激组的细胞培养上清可促进HASMCs增殖(p<0.01)。加入特异性AT1受体拮抗剂洛沙坦预处理HASMCs30min后,被动致敏+AngⅡ+Lostarn组与Ang Ⅱ (10-7mol/l)+哮喘血清刺激组比较,其细胞培养上清对HASMCs增殖促进作用明显下降(p<0.01),但与单纯哮喘血清刺激组比较,仍有显著性差异(p<0.05)；加入ERKl/2信号传导通路抑制剂PD98059预处理HASMCs30min后,被动致敏+Ang Ⅱ+PD98059组与Ang Ⅱ (10-7mol/l)+哮喘血清刺激组比较其细胞培养上清对HASMCs增殖促进作用明显下降(p<0.01),但与单纯哮喘血清刺激组比较,仍有显著性差异(p<0.05)；表明富含COL-1等细胞外基质蛋白的细胞培养上清对HASMCs增殖具有一定的促进作用,AT1受体拮抗剂具有一定间接减弱作用。五、结论本研究从被动致敏HASMC入手,发现AngⅡ (10-7mol/l)处理组有关COLI的结果检测均与单纯被动致敏组明显不同。COL Ⅰ-α1mRNA表达水平及蛋白含量显著高于单纯被动致敏组,表明AngⅡ (10-7mol/l)有促进被动致敏HASMC分泌COLI的作用。为了验证AngⅡ的促分泌作用是否通过AT1受体介导,我们加入AT1受体拮抗剂洛沙坦(10-6mol/l)干预。结果表明,与被动致敏-Ang Ⅱ组相比,被动致敏+Ang Ⅱ+Lostarn组COL Ⅰ-α1mRNA表达水平及蛋白含量均明显下降,与单纯被动致敏组相比无统计学差异,表明AngⅡ对被动致敏HASMC分泌COLI的促进作用主要是由AT1R介导的,AT1受体拮抗剂洛沙坦可阻断这一作用。为了验证AngⅡ是否通过ERK1/2通路发挥其促分泌作用,我们在加入AngⅡ前30min加入PD98059(10-5mol/l)预处理。结果表明,与被动致敏+AngⅡ组相比,被动致敏+Ang Ⅱ+PD98059组COL Ⅰ-almRNA表达水平及蛋白含量均明显下降,与单纯被动致敏组相比无统计学差异,表明AngⅡ可能通过ERK1/2通路发挥其促分泌作用。MTT结果显示,AngⅡ组COL-I含量较高的细胞培养上清,对HASMCs增殖具有一定的促进作用。综上所述, HASMC在AngⅡ等刺激因素作用下可分泌过多的COL-I等ECM组分,而改变后的ECM反过来作用于HASMC,促进其增殖,表明ECM沉积变化在哮喘气道重塑中具有重要作用