小麦TaCKX1基因功能的研究

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细胞分裂素(cytokinin,CK)是一类具有多重作用的植物激素,能够促进植物细胞分裂分化、提高籽粒产量、调控非生物胁迫等。细胞分裂素氧化/脱氢酶(cytokinin oxidase/dehydrogenase,CKX)是唯一不可逆降解细胞分裂素的酶。普通小麦(Triticum aestivum L.)属于禾本科植物,是世界上三大粮食作物之一,为人类提供了约20%的蛋白质和热量。因此,研究Ta CKX基因的功能对培育优质、高产的小麦品种具有重要意义。本研究鉴定了部分济麦22号(JM22)小麦M2代Ta CKX1突变株系,通过分析Ta CKX1突变株系的株高、千粒重及不同时期Ta CKX1基因相对表达量,初步研究了Ta CKX1基因突变的表型效应。通过对小麦原生质体制备及瞬时转化体系的优化,检测了实验室前期构建的靶向Ta CKX1的CRISPR/Cas9基因编辑载体活性。在优化小麦遗传转化体系的基础上,获得了p Ta CKX1-g1转基因阳性植株,为进一步研究Ta CKX1基因的功能奠定了材料基础。主要研究结果如下:1.Ta CKX1突变株系的鉴定及其生理功能和基因表达分析为研究Ta CKX1基因的功能,共获得了6个M2代Ta CKX1突变株系(JM5、JM23、JM52、JM98、JM138和JM274)。克隆测序验证表明它们均存在C→T或G→A的EMS诱变类型的单碱基突变。对鉴定成功的突变株系进行株高、千粒重和Ta CKX1基因表达分析发现:JM274的株高及千粒重均显著高于其他株系,且花期与成熟期的Ta CKX1基因表达量低于其他株系,表明Ta CKX1基因是细胞分裂素的负调控因子,与小麦产量密切相关。2.济麦22号原生质体制备及瞬时表达体系的优化与Ta CKX1基因编辑载体活性检测为了检测Ta CKX1基因编辑载体活性,对小麦原生质体的制备和转化条件进行了优化。本研究通过设计正交实验确定了济麦22号小麦原生质体制备的最佳条件。结果发现酶解液中纤维素酶浓度为1.5%、离析酶浓度为0.5%、甘露醇浓度为0.8 mol/L,25℃黑暗条件下酶解3 h得到的原生质体完整性最好,原生质体产量达6.97×10~6个/m L,活性达93.99%,均高于其他组合。在原生质体浓度为2×10~5个/m L、PEG-4000浓度为25%、质粒浓度为1μg/μL及转化时间为20 min的条件下,利用PEG-Ca2+介导法将表达绿色荧光蛋白的重组质粒p AN580载体瞬时转化原生质体后,转化效率达到65.22%。将Ta CKX1基因编辑载体转入原生质体后,发现有一个具有编辑活性,将其命名为p Ta CKX1-g1。3.小麦遗传转化体系的优化及p Ta CKX1-g1转基因阳性植株鉴定利用农杆菌介导法将p Ta CKX1-g1载体转入小麦幼胚,通过诱导、分化愈伤组织等步骤获得38株转基因植株,再通过提取植株DNA、PCR扩增、酶切、特异引物扩增、酶切等实验步骤,在A亚基因组鉴定出2个p Ta CKX1-g1转基因阳性植株,在B亚基因组鉴定出1个p Ta CKX1-g1转基因阳性植株,为后续进一步研究Ta CKX1基因功能奠定了材料基础。
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