第一部分环境毒素诱发多巴胺能神经元异常蛋白水解应激状态及其机制的研究　　 第一节:环境毒素诱发多巴胺神经元α-突触核蛋白选择性聚集　　 目的：探讨环境毒素诱发多巴胺能神经元内α-突触核蛋白选择性聚集的作用及影响因素。　　 方法：6-OHDA、MPP+、鱼藤酮作用于NGF 诱导的PC12 细胞，MTT 法检测各种药物的神经毒性作用，应用共聚焦免疫荧光双标染色观察药物处理后细胞形态变化，胞浆内α-synuclein 及泛素的表达及蛋白聚集现象。采用NGF 诱导的PC12 细胞和N2a 细胞进行对比，同样方法观察两种细胞株内α-synuclein蛋白的聚集，其后采用利血平预处理耗竭胞浆内多巴胺观察以上蛋白聚集体的变化。　　 结果：三种神经诱变剂处理PC12 细胞后，细胞活力呈浓度依赖性下降，其中6-OHDA100 μM、MPP+75 μm、鱼藤酮20nM作用24h 使细胞活力分别下降52％、44[％]、40[％](P＜0.01)。　　 结论：以上三种神经诱变剂均导致了DA 能神经元内选择性α-synuclein和泛素化蛋白的聚集，提示氧化应激及线粒体功能障碍可能是其主要机制，同时多巴胺在α-synuclein蛋白聚集过程中为一重要调节因素。　　 第二节:环境毒素对泛素蛋白酶体损伤的研究　　 目的：探讨环境毒素导致泛素蛋白酶体损伤，诱发蛋白水解应激在多巴胺能神经元变性死亡中的作用。　　 方法：6-OHDA、MPP+、鱼藤酮及泛素蛋白酶体抑制剂Lactacystin作用于NGF 诱导的PC12 细胞，荧光分光光度计测量各组细胞蛋白酶体中各蛋白水解酶活性的变化。免疫印迹方法检测各药物处理组PC12 细胞内泛素化蛋白的水平。应用共聚焦免疫荧光双标染色观察Lactacystin处理后PC12 细胞内α-synuclein 及泛素的表达及蛋白聚集现象。　　 结果：荧光底物酶活性测定提示MPP+75 μm、鱼藤酮20nM处理使胰蛋白酶，糜蛋白酶及PgH 水解酶活性明显下降(P<0.05)，而6-OHDA 100 μM处理使各蛋白酶水解能力轻度降低，但统计学分析无显著性差异(P>0.05),6-OHDA 200 μM 则诱导三种蛋白酶活性进一步下降，荧光指数分别为7.23±0.58，79.6±2.73和4.23±0.49(正常组为13.9±1.75，99.3±5.23和6.90±0.60，P＜0.05)。　　 结论：以上三种神经诱变剂可导致了DA 能神经元泛素蛋白酶体功能失调，提示氧化应激及线粒体功能障碍可能是环境毒素诱发蛋白水解应激状态的主要机制，而泛素蛋白酶体通路的功能缺失造成了细胞内泛素化蛋白和α-synuclein的积聚，可能在帕金森病黑质多巴胺能神经元变性死亡和小体形成中发挥重要作用。　　 第二部分内质网应激反应及其相关性凋亡通路在帕金森病中的研究　　 第一节:内质网未折叠蛋白反应与帕金森病:细胞模型的研究　　 目的：探讨内质网应激反应及相关凋亡途径在多巴胺能神经元变性死亡中的作用。　　 方法：6-OHDA、MPP+、鱼藤酮作用于NGF 诱导的PC12 细胞，流式细胞仪方法检测各种药物的神经毒性作用及细胞凋亡率，应用RT-PCR和免疫组织化学技术观察以上药物处理后ERS 通路中Grp78、CHOP 表达水平的变化，相关凋亡因子caspase-12的转录水平和利血平耗竭胞内DA 水平后的影响。　　 结果：三种神经诱变剂处理PC12 细胞后，流式细胞仪显示细胞凋亡率呈时间依赖性增高，在24h 时分别达到31.22±3.21[％]，27.46±2.35[％]，29.26±2.53[％](正常组3.71±2.25[％]，P<0.01)。　　 结论：内质网未折叠蛋白反应与帕金森病密切相关，适度的UPR 发挥保护作用，但持久应激诱发的相关凋亡途径是DA 能神经元选择性变性死亡的内在环节之一。　　 第二节:蛋白水解应激诱发内质网应激在帕金森病中的作用　　 目的：探讨泛素蛋白酶体(ubiquitin proteasome,UP)功能失调诱发的内质网应激反应(endoplasmic reticulum stress response，ERS)机制在多巴胺(dopamine，DA)能神经元变性死亡中的作用。　　 方法：泛素蛋白酶体抑制剂lactacystin作用于NGF 诱导的PC12 细胞，MTT 及流式细胞仪检测lactacystin的神经毒性作用和细胞凋亡，应用RT-PCR和Western blot 技术观察剂lactacystin处理后ERS 通路中Grp78、CHOP 表达水平的变化，相关凋亡因子caspase-12的活化及利血平耗竭胞内DA 水平后的影响。　　 结果：5～20μM lactacystin处理PC12 细胞后，细胞活力呈浓度依赖性下降，其中lactacystin 10μM作用24h 使细胞活力下降51[％]。在相同浓度条件下(10μM)流式细胞仪显示的细胞凋亡率在4h、8h、16h、24h 内逐渐增高(6.1[％]、14.1[％]、24.9[％]、30.9[％])(P<0.01)。　　 结论：泛素蛋白酶体是内质网相关降解通路之一，由于蛋白水解应激导致的UPS 功能受损是诱发持续内质网应激反应，导致细胞凋亡的重要因素。　　 第三部分格尔德霉素诱导热休克蛋白反应抑制鱼藤酮对DA能神经元的神经毒性作用　　 目的：探讨格尔德霉素(GA)通过诱导热休克蛋白(HSP)反应抑制鱼藤酮诱发多巴胺能神经元变性死亡的神经保护作用。　　 方法：鱼藤酮作用于NGF 诱导的PC12 细胞建立PD 离体细胞模型，MTT 法检测鱼藤酮组，GA 不同浓度及用药时程预处理条件下的细胞活力，应用TUNEL 方法观察GA 预处理后对鱼藤酮诱发细胞凋亡的影响。Western blot 技术观察鱼藤酮组及GA 不同浓度预处理组中热休克蛋白70和热休克蛋白40 表达的变化。　　 结果：MTT 示鱼藤酮20nM作用24h 使细胞活力显著下降至正常的59％，而GA20nM～300nM 预处理组细胞活力呈浓度依赖性上升，吸光度分别上升至正常的65[％]，76[％]，85[％]和94[％](与鱼藤酮组比较，P＜0.01)，但GA与鱼藤酮同时给药或作用于其后20h 细胞活力无明显变化。　　 结论：格尔德霉素预处理可诱发热休克蛋白反应，主要通过HSP70 及HSP40的协同作用发挥神经保护作用。　　 第四部分格尔德霉素诱导热休克蛋白70高表达抑制DA能神经元内蛋白水解应激及氧化应激水平的研究　　 目的：探讨格尔德霉素(GA)通过诱导热休克蛋白70 表达抑制α-突触核蛋白(α-syn)异常表达，加强泛素蛋白酶体降解功能，减轻氧化应激的神经保护作用机制。　　 方法：鱼藤酮作用于NGF 诱导的PC12 细胞建立α-syn 胞浆内过表达PD 细胞模型，应用共聚焦免疫荧光双标染色观察GA预处理后细胞内HSP70和α-syn的表达。荧光分光光度计测量各组细胞内蛋白酶体水解酶活性的变化。2 ’7 ’-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)荧光染色检测各组细胞内活性氧水平。　　 结果：共聚焦显微镜观察显示鱼藤酮诱发α-syn过表达及在胞浆内的蛋白聚集颗粒，Hsp70 表达轻度增加，GA 预处理组Hsp70 表达显著增加，同时α-syn的过表达及聚集现象得以明显抑制，两者存在共定位现象。　　 结论：格尔德霉素可诱发热休克蛋白反应，主要通过HSP70的作用抑制α-syn的异常表达，促进泛素蛋白酶体降解功能，缓解蛋白水解应激，减轻氧化损伤，发挥神经保护效应。　　 第五部分格尔德霉素预处理对内质网应激反应的调节作用 　　 目的：观察探讨格尔德霉素(GA)预处理对鱼藤酮诱发的内质网应激及其凋亡因子的调节作用。　　 方法：NGF 诱导的PC12 细胞分别予以不同浓度(20～400nM)的格尔德霉素预处理4～20h，继而20nM 鱼藤酮再孵育24h。应用RT-PCR 方法观察各GA 预处理组中ERS 通路伴侣蛋白Grp78 及凋亡因子CHOP，caspase-12 转录水平的变化。　　 结果：鱼藤酮诱发PC12 细胞内质网应激产物Grp78，CHOP,caspase-12基因转录水平的增加(P＜0.01)。　　 结论：格尔德霉素预处理可抑制鱼藤酮诱发的内质网应激相关凋亡，但高浓度条件下可导致相反作用，其机制推测与格尔德霉素对Hsp90，Grp94的抑制作用相关。