研究目的:聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1(Poly(ADP-ribose)polymerases 1,PARP1)是真核细胞内具有多聚腺苷二磷酸核糖基催化活性的蛋白酶,能催化多种底物蛋白发生聚核糖基化修饰,对DNA损伤修复及基因转录发挥重要的调控作用。关于PARP1在DNA同源重组修复中的作用研究较为深入,临床用于肿瘤治疗的PARP抑制剂正是基于该功能发展而来。而PARP1对基因转录的调控作用则是近年来逐渐被关注的问题,PARP1通过核糖基化修饰转录因子抑制其转录活性,抑制相关靶基因转录,从而在免疫细胞成熟及脂肪形成等多种生物学过程发挥重要调控作用。但由于核糖基化修饰位点特征性较弱,当前缺乏高效筛选技术来发现可被核糖基化修饰的底物蛋白,PARP1对基因转录调控的研究进展缓慢。肿瘤细胞存在多种机制逃避机体免疫系统识别和攻击,包括免疫抑制分子表达、低免疫原性、抗原调变以及物理屏障产生等,从而得以在体内生存和增殖。其中肿瘤细胞表达的免疫抑制分子程序性死亡配体-1(Programmed death ligand-1,PD-L1)在肿瘤免疫逃逸过程中具关键作用。正常组织也表达PD-L1,与T细胞表面的程序性死亡受体-1(Programmed death-1,PD-1)结合从而抑制T细胞激活,以避免由于T细胞过度激活而引发的自身免疫病。因此,PD-L1/PD-1在维持机体保护性免疫和免疫耐受平衡中起重要作用。然而,肿瘤细胞因为进化过程中癌基因激活、微环境细胞因子刺激及信号通路持续活化等原因高度表达PD-L1,以抑制T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力,从而实现免疫逃逸致使肿瘤细胞无限生长和增殖。因此,深入研究PD-L1的调控机制对发展基于PD-L1的肿瘤干预策略非常重要。PARP抑制剂作为主要靶向PARP1蛋白的小分子抑制剂,通过抑制肿瘤细胞的DNA修复而发挥合成致死效应,目前临床上已经应用于卵巢癌的治疗中。然而,临床数据显示PARP抑制剂对卵巢癌患者的总生存时间(Overall survival,OS)并无显著改善作用,如何进一步提高PARP抑制剂的临床治疗效果成为该领域的焦点问题。有研究表明PARP抑制剂疗效欠佳的原因是其它具有DNA同源重组修复作用的蛋白发挥了代偿作用,但这也只是在部分患者中得到了证实。总体来说,PARP抑制剂临床效果欠佳的原因远未阐明。综上,本研究旨在考察PARP1对卵巢癌细胞免疫检查点蛋白PD-L1的调控作用及相关分子机制:(1)PARP1对肿瘤细胞PD-L1转录的调控作用;(2)PARP1通过核糖基化转录因子STAT3抑制PD-L1的转录;(3)STAT3核糖基化修饰与磷酸化修饰之间的相互关系。本项目发现PARP1在肿瘤免疫逃逸中的新生物学功能,进一步完善了 PARP1调控基因表达的理论;发现PD-L1新的调控机制;STAT3新的生物学功能;有可能从免疫逃逸这一新的角度揭示影响PARP抑制剂临床疗效欠佳的原因。第一部分PARP1对PD-L1的转录调控作用研究研究方法:本研究分别采用人源卵巢癌细胞株SKOV3及OVCAR8、人源肺癌细胞株A549及PC9、人源结肠癌细胞株SW620及Co1o205、人源乳腺癌细胞株MCF-7、人原代卵巢癌细胞、人原代肺癌细胞,以及体外T细胞和肿瘤细胞共孵育模型评价PARP1的沉默或活性抑制对PD-L1的调控以及对T细胞活性抑制的作用。(1)通过siRNA转染技术干扰PARP1的表达,采用qRT-PCR法考察不同肿瘤细胞中PARP1活性抑制对PD-L1的转录调控作用;(2)通过双荧光素酶报告基因法考察PARP1活性抑制后对PD-L1转录的影响;(3)通过流式细胞术和Western blotting法考察不同细胞株中PARP1活性抑制后对PD-L1膜蛋白及总蛋白的影响;(4)通过单细胞分离技术分离出肿瘤病人的原代肿瘤细胞,通过Western blotting考察PARP1对PD-L1蛋白的调控作用;(5)构建PARP1质粒,考察PARP1蛋白高表后对PD-L1的影响;(6)分离出人的外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)构建肿瘤细胞和T细胞的共孵育模型,考察PARP 1调控PD-L1后对T细胞活性的影响;(7)采用免疫组化手段,考察卵巢癌病人肿瘤组织切片中PARP1和PD-L1的表达关系;(8)通过流式细胞术及磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)实验考察PARP抑制剂对细胞增殖及凋亡的影响;(9)通过T细胞共孵育实验,采用酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immuno sorbent assay,Elisa)检测PARP1干预后对T细胞分泌IL-2和Granzyme B的影响。研究结果:(1)PARP1抑制PD-L1的转录水平通过siRNA干扰技术瞬时沉默卵巢癌细胞株中的PARP1蛋白,结果显示,沉默PARP1后,PD-L1的转录水平显著上调;且沉默PARP1的细胞株中PD-L1的膜表面蛋白及总蛋白水平显著上调并且与其沉默效率相关;同时在多株肿瘤细胞肺癌细胞株、结肠癌细胞株及乳腺癌细胞株中对PARP1进行沉默,均能观察到PD-L1的蛋白水平显著上调。提示,PARP1转录调控PD-L1水平的生物学现象在多种肿瘤中均存在。(2)PARP1转录调控PD-L1与其酶活相关性的考察为了考察PARP1调控PD-L1的作用是否依赖其核糖基化聚合酶活性,我们引入了 PARP抑制剂。在卵巢癌OVCAR8和SKOV3细胞上给予多种PARP抑制剂作用后,在不影响肿瘤细胞增殖和凋亡的情况下,PD-L1的mRNA水平及蛋白水平均有显著上调,而PD-L1的蛋白稳定性不受影响;同时通过Luciferase实验我们发现使用PARP抑制剂后可以显著增强PD-L1的蛋白的转录活性,这进一步提示PARP1的活性抑制或者缺失是通过转录途径调控PD-L1的表达的。我们还评估了另一种细胞表面免疫抑制因子CD47的表达,在PARP1沉默后其mRNA水平上没有显著改变,并且细胞表面CD47的表达不受PARP抑制剂Olaparib的显著影响。(3)PARP1调控PD-L1的表达对T细胞活性的影响我们通过构建肿瘤细胞与T细胞共孵育模型考察抑制PARP1活性、沉默PARP1以及过表达PARP1蛋白所引起的PD-L1蛋白水平的变化对T细胞功能的影响,结果显示,过表达PARP1蛋白可以恢复T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用,促进T细胞中IL-2和Granzyme B的分泌;而抑制PARP1的活性及沉默PARP1均抑制T细胞的活性,减少IL-2和Granzyme B的分泌;同样的在人原代肿瘤细胞中给予了 PARP抑制剂抑制PARP1的活性或者沉默PARP1均可以显著上调PD-L1的水平,且PARP1过表达能抑制PD-L1的表达;此外我们在原代病人肿瘤样本的组织切片中也发现PARP1与PD-L1存在负相关,提示在病人肿瘤细胞中也存在PARP1调控PD-L1的情况。第二部分PARP1通过核糖基化STAT3调控PD-L1的作用研究研究方法:本研究采用卵巢癌细胞株SKOV3及OVCAR8对PD-L1的转录因子进行筛选,锁定STAT3是参与PARP1调控PD-L1的转录因子,并通过工具细胞HEK 293T细胞体外蛋白结合以及核糖基化反应的模型对STAT3参与调控的作用进行明确。(1)通过siRNA干扰技术对PD-L1的转录因子STAT3、STAT1以及MYC等进行干扰,再采用流式细胞术考察在几种转录因子缺失的情况下,PARP1对PD-L1的上调作用;(2)通过siRNA干扰技术筛选到转录因子STAT3,采用qRT-PCR法考察卵巢癌细胞中STAT3在PARP抑制剂Olaparib调控PD-L1中的作用;(3)通过外源性过表达PARP1和STAT3,采用双荧光素酶报告基因法考察两者的存在对PD-L1转录的调控作用;(4)采用染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)的实验方法,考察 PARP 1 活性抑制后,STAT3 与 PD-L1 promotor区域的结合情况;(5)通过对TCGA数据库对563位卵巢癌病人进行数据分析,考察STAT3靶基因的表达与PD-L1表达之间的相关性;(6)通过免疫共沉淀的方法,考察STAT3与PARP1之间的结合情况以及STAT3发生核糖基化修饰的情况;(7)通过双荧光素酶报告基因法考察核糖基化位点突变的P ARP 1对STAT3介导的PD-L1的转录调控影响;(8)通过流式细胞术考察核糖基化位点突变的PARP1对PD-L1膜表面蛋白的影响。研究结果:(1)PARP1通过STAT3调控PD-L1的转录首先对PD-L1转录因子STAT1、STAT3以及MYC进行siRNA干扰,再给予P ARP抑制剂进行干预处理,通过流式细胞术进行检测,我们发现在MYC和ST AT 1沉默的情况下PARP抑制剂仍旧能够上调PD-L1的膜蛋白水平,而沉默STAT3之后,PARP抑制剂上调PD-L1的作用被显著抑制了;为了进一步明确我们得到的结果,我们在卵巢癌细胞以及乳腺癌细胞中都对STAT3进行了沉默,得到的结果均一致;同时我们发现沉默了 STAT3之后,PARP抑制剂促进PD-L1的转录的功能也被显著抑制了;为了进一步明确STAT3的确参与到了 PARP1转录调控PD-L1的作用中,我们又进行了 Luciferase实验以及ChIP实验,结果显示STAT3外源性过表达后的确能够显著促进PD-L1的转录,并且这种作用在外源性过表达PARP1后被显著削弱了,而当使用PARP抑制剂抑制PARP1活性后,STAT3蛋白与PD-L1 promotor区的结合也显著增强了;我们基于cBio-Portal提供的大规模癌症基因组学数据分析了 TCGA数据库中包含563个样本的卵巢浆液性囊腺癌数据集,发现五个著名的STAT3靶基因MCL1,CCL5,IFNG,IL4R和IL2RA的mRNA表达与CD274(PD-L1的编码基因)的mRNA表达相关,进一步表明PD-L1的表达与STAT3活性呈正相关。基于以上实验我们可以明确STAT3参与了 PARP1调控PD-L1的转录过程中。(2)PARP1和STAT3结合并发生核糖基化修饰为了考察STAT3与PARP1之间存在的关系,我们通过免疫共沉淀的方法,发现无论是在内源表达的情况下还是在PARP1与STAT3过表达的情况下,STAT3与PARP1之间都存在结合,并且这种结合在抑制PARP1活性后被打破;同时在PARP1存在的情况下我们又对STAT3上的修饰进行考察,我们发现STAT3能够发生核糖基化修饰;在给予PARP抑制剂抑制PARP1活性后我们发现STAT3的核糖基化修饰也随之消失了。基于以上实验,我们可以明确PARP1通过其核糖基化酶活功能对STAT3产生核糖基化修饰作用。(3)PARP1通过核糖基化STAT3调控PD-L1的表达为了进一步明确PARP1对STAT3的核糖基化修饰作用是否会影响PD-L1的转录,我们考察了 STAT3对PD-L1的转录调控作用是否会受PARP1核糖基化酶活突变的质粒(PARP1-H862A和PARP1-E988K)的影响。结果显示,PARP1活性缺失后,STAT3的确无法发生核糖基化修饰,并且核糖基化功能缺失的PARP1丧失了抑制STAT3转录活性的作用,且对PD-L1蛋白水平也没有产生抑制作用,提示PARP1的确通过核糖基化STAT3来发挥调控PD-L1水平的作用。第三部分STAT3核糖基化与磷酸化修饰之间的关系研究研究方法:本研究分别采用人源卵巢癌细胞株SKOV3及OVCAR8、人源肺癌细胞株A549及PC9、人源结肠癌细胞株SW620及Co1o205、人源乳腺癌细胞株MCF-7对PARP1调控p-STAT3的作用进行考察明确。通过构建STAT3不同磷酸化程度的质粒考察其核糖基化水平的变化,进一步再采用流式分选、流式双染以及免疫组化等手段对STAT3的PARylation和Phosphorylation之间的关系进行明确,并进一步在工具细胞上对STAT3的PARylation如何影响其Phosphorylation的机制进行了探讨。(1)通过Western blotting在多种肿瘤细胞中,对PARP抑制剂以及siRNA转染技术干扰PARP1后p-STAT3水平的变化情况进行考察;(2)通过免疫荧光手段及核质分离技术,对PARP1活性抑制或者沉默后STAT3的核内外分布情况进行考察;(3)对膜表面的PD-L1以及核内的p-STAT3进行双染,通过流式细胞术,考察沉默PARP1后同时表达这两种蛋白的细胞比例的变化;(4)通过Western blotting,考察野生型PARP1以及核糖基化功能缺失的PARP1对p-STAT3水平的影响;(5)通过分子克隆构建STAT3野生型质粒、STAT3持续磷酸化的质粒STAT3C,以及STAT3磷酸化功能突变的质粒STAT3Y705F,并进行免疫共沉淀实验考察STAT3 PARylation水平的变化;(6)通过流式分选,分离出Olaparib作用后PD-L1高水平的细胞以及PD-L1低水平的细胞,并考察其p-STAT3的水平变化,同时待两群分选出的细胞培养一段时间使其恢复基线水平后,又通过Western blotting对这两群细胞的核糖基化水平进行明确;(7)通过Western blotting,对比不同肿瘤细胞中p-STAT3水平以及PARylation水平之间的关系;(8)通过免疫组化对肿瘤病人组织芯片中PARylation和Phosphorylation之间的关系进行考察;(9)通过Western blotting,对PARP1调控p-STAT3的激酶以及磷酸酶的途径进行考察,明确影响途径;(10)通过免疫共沉淀的方法对参与STAT3去磷酸化作用的磷酸化酶进行筛选,并考察PARR1对STAT3与其磷酸酶的结合作用的影响。研究结果:(1)PARP1可以调控STAT3的磷酸化在不同肿瘤细胞上对P ARP 1进行沉默或者使用不同的P ARP抑制剂对P ARP 1的核糖基化酶活功能进行抑制,结果显示,在多种肿瘤中沉默或者抑制PARP1活性后均能上调p-STAT3的水平;同时,免疫荧光及核质分离的结果显示沉默或者抑制PARP1活性后能促进STAT3蛋白的入核;为了考察PARP1引起的STAT3的磷酸化的确会对PD-L1蛋白产生影响,我们又通过流式双染考察了 p-STAT3与PD-L1双阳性的细胞在PARP1沉默后的比例变化,结果显示,沉默PARP1可以显著上调同时表达p-STAT3以及PD-L1的细胞数量;为了更加明确PARP1的核糖基化功能对STAT3磷酸化作用的影响,我们又引入了 PARP1核糖基化酶活位点突变的质粒,结果显示,PARP1核糖基化功能缺失之后,其抑制STAT3磷酸化水平的功能消失了。通过以上实验,我们发现PARP1可以通过影响STAT3的磷酸化使其发挥调控PD-L1的作用。(2)STAT3的磷酸化与核糖基化之间的关系明确了 PARP1能通过核糖基化影响STAT3的磷酸化水平,接着我们就对PARylation和Phosphorylation之间的关系进行考察。我们构建了三种不同磷酸化水平的STAT3质粒,STAT3野生型、STAT3持续磷酸化的质粒STAT3C以及STAT3磷酸化功能缺失的质粒STAT3Y705F,通过外源性过表达PARP1和这三种质粒从而考察STAT3 PARylation水平的变化,结果显示磷酸化水平最高的STAT3C的核糖基化水平最高,野生型STAT3次之,而磷酸化缺失的质粒则无核糖基化修饰。同样的使用JAK2抑制剂AZD1480抑制p-STAT3后其核糖基化修饰消失,以此看出STAT3的磷酸化水平也会影响到STAT3的核糖基化水平;通过对给予PARP抑制剂的肿瘤细胞进行流式分选发现,PD-L1表达高的一群细胞的p-STAT3水平也高,且当PD-L1高表和低表的两群细胞经过几次培养回到基线水平后,我们发现能被PARP抑制剂上调的那群细胞中,其原本基础核糖基化水平较高,即PARP1的基础活性较高,这也进一步明确了 PARP1的活性与STAT3的磷酸化以及PD-L1的水平间的相关性;最后我们对人卵巢癌病人组织芯片进行了组化染色,发现核糖基化水平与磷酸化STAT3的水平之间呈现负相关性。综上所述,STAT3核糖基化修饰与磷酸化修饰存在相互影响,并呈负相关作用。(3)PARP1通过PTPN9调控STAT3的磷酸化为了确定PARP1如何调控STAT3的磷酸化,我们对STAT3的激酶JAK2以及磷酸酶进行考察,我们发现,沉默了 PARP1后对JAK2的磷酸化无影响;当我们使用了磷酸酶抑制剂后,PARP 1调控STAT3的磷酸化作用消失。由此我们推测PARP1通过影响STAT3的磷酸酶来调控其磷酸化水平的作用;为此我们又对已报道的STAT3的磷酸酶进行筛选,结果显示,PTPN9可以与STAT3以及PARP1形成复合物,并且过表达PARP1或抑制PARP1活性可以增加或减少PTPN9与STAT3的结合。由此我们可以得出的结论是PARP1通过PTPN9来发挥抑制STAT3磷酸化的作用。研究结论:在这项研究中,我们发现PARP1蛋白的沉默或通过PARP抑制剂抑制其核糖基化酶活功能,均能显著增强不同肿瘤细胞中PD-L1的转录,并伴随着PD-L1蛋白在细胞质和细胞表面的表达上调。而在转录因子STAT3缺失的情况下,PARP1对PD-L1的调控作用被明显抑制。体外实验研究表明PARP1与STAT3直接相互作用,并引起STAT3发生核糖基化修饰。同时,STAT3对PD-L1转录的激活被野生型PARP1的过表达所消除,而外源性过表达PARP1核糖基化功能突变的质粒则对STAT3的转录活性没有抑制作用,这提示,PARP1对STAT3的核糖基化修饰在PD-L1的调控中非常重要。同样,PARP1的沉默或活性抑制均增强了 STAT3的磷酸化水平,野生型PARP1的外源性过表达可以显著抑制这种STAT3的磷酸化上调,而核糖基化位点突变的PARP1则不能。在临床卵巢癌样本中还观察到PARP1和PD-L1以及PARylation和Phosphorylation呈负性相关。总体而言,我们的研究表明PARP1介导的STAT3的PARylation是抑制PD-L1转录的关键步骤,这种机制存在于多种肿瘤细胞中。