第一部分 自噬在大鼠脊髓损伤后神经源性膀胱不同时间点的表达研究目的:建立大鼠脊髓损伤模型,观察自噬在脊髓损伤后神经源性膀胱不同时间点膀胱逼尿肌中的表达。研究方法:36只雄性Wistar大鼠随机分为脊髓损伤组和假手术组。对照组只接受T10-T11水平的椎板切除术,而不损伤脊膜;实验组大鼠采用改良的Allen’s法进行脊髓损伤的手术。两组均在术后1天、4天和14天进行运动评分和膀胱功能评估。在每一个时间点,每组都随机选出6只实验动物被处死,取材。使用BBB功能评定量表评定大鼠的运动功能情况;使用膀胱残余尿量和膀胱功能评分评估大鼠膀胱功能;Western blotting检测大鼠膀胱组织中的LC3蛋白表达;应用免疫荧光法检测自噬相关指标LC3、P62,观察其阳性细胞表达;实时荧光定量RT-PCR对大鼠膀胱组织检测自噬活动相关基因LC3、P62 mRNA水平。结果:实验发现,脊髓损伤组大鼠术后双下肢功能丧失,并拖地行走,但是从术后1天开始,大鼠下肢功能逐渐恢复。脊髓损伤组大鼠术后膀胱功能出现障碍,但是随着时间逐渐有所恢复。Western blot结果显示,与假手术组相比,脊髓损伤组大鼠逼尿肌LC3-Ⅱ蛋白表达显著增高(P<0.01),而且在术后4天达到最高值。免疫荧光染色结果显示在术后1天、4天、14天,脊髓损伤组逼尿肌LC3-Ⅱ的表达较假手术组明显在增加(P<0.05)。同时,术后1天,脊髓损伤组逼尿肌P62有表达,但是术后4天较假手术组表达减少,并持续到术后14天。RT-PCR结果显示,在术后1天、4天、14天脊髓损伤组逼尿肌LC3mRNA表达较假于.术组明显增加,结果显示在术后4天,术后4天脊髓损伤组大鼠膀胱逼尿肌LC3mRNA的表达较术后1天明显增加,但是术后14天脊髓损伤组大鼠膀胱逼尿肌LC3mRNA的表达较术后4天有所减少:RT-PCR结果显示,术后1天,脊髓损伤组大鼠膀胱逼尿肌P62mRNA表达与假手术组相比无明显差别;术后4天和术后14天,脊髓损伤组大鼠膀胱逼尿肌P62mRNA表达与假手术组相比明显减少,但是,术后14天脊髓损伤组大鼠膀胱逼尿肌P62mRNA表达较术后4天有所增加。结论:脊髓损伤后膀胱逼尿肌中自噬被激活,并持续相当长的一段时间;自噬的表达与膀胱功能和运动功能的恢复相一致,提示自噬可能参与膀胱和运动功能的恢复;自噬可能在神经源性膀胱发生发展过程中发挥一定的作用,并可能参与膀胱逼尿肌的自我修复。第二部分:3-MA通过抑制自噬反应对大鼠脊髓损伤后神经源性膀胱的作用研究研究目的:通过自噬抑制剂3-MA的干预,观察对大鼠脊髓损伤后神经源性膀胱的影响及膀胱逼尿肌细胞中自噬的表达。研究方法:27只雄性wistar大鼠随机分为空白对照组,脊髓损伤组和3-MA注射组。空白对照组只接受T10-T11水平的椎板切除术,而不损伤脊膜;脊髓损伤组和3-MA注射组大鼠采用改良的Allen’ s法进行脊髓损伤的手术,造模完成后,3-MA注射组大鼠腹腔注射3-MA(2mg/kg),脊髓损伤组和空白对照组注射同等剂量的生理盐水。在术后1天、4天、14天进行运动评分、残余尿量、膀胱功能评分,在每一个时间点,每组都随机选出3只实验动物被处死,取材。使用BBB功能评定量表评定大鼠的运动功能情况;使用膀胱残余尿量和膀胱功能评分评估大鼠膀胱功能;Western blotting检测大鼠膀胱组织中的LC3蛋白表达;应用免疫荧光法检测自噬相关指标LC3、P62,观察其阳性细胞表达;实时荧光定量RT-PCR对大鼠膀胱组织检测自噬活动相关基因LC3mRNA、P62mRNA水平。结果:造模后,脊髓损伤组和3-MA注射组的下肢基本没有运动功能,而假手术组的大鼠运动功能没有受损。与脊髓损伤组相比,3-MA注射组的BBB评分降低,差距有统计学意义(P<0.05)。从术后1天至术后14天,脊髓损伤组和3-MA注射组的膀胱残余尿量逐渐减少,特别是术后3天至术后9天。但是,3-MA注射组的残余尿量相比脊髓损伤组增加,差距具有统计学意义(P<0.05)。3-MA注射组术后比脊髓损伤组在术后1天、9天、12天、14天的膀胱功能评分降低,差距有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示在术后1天、4天、14天3-MA注射组LC3-Ⅱ蛋白表达较脊髓损伤组均有所降低,差距有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR结果显示在术后1天、4天、14天,3-MA注射组膀胱逼尿肌LC3 mRNA的表达比脊髓损伤组均有所降低,差距有统计学意义(P<0.05);在术后4天、14天,3-MA注射组膀胱逼尿肌P62mRNA的表达比脊髓损伤组均有所升高,差距有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光染色结果显示在术后1天、4天、14天3-MA注射组LC3蛋白的阳性细胞率比脊髓损伤组均有所降低,差距有统计学意义(P<0.05);在术后1天、4天、14天3-MA注射组P62蛋白的阳性细胞率比脊髓损伤组均有所升高,差距有统计学意义(P<0.05)。结论:腹腔内注射自噬抑制剂3-MA抑制了脊髓损伤后大鼠膀胱逼尿肌自噬的表达,对膀胱功能的恢复和下肢运动功能的恢复产生影响,抑制了功能的恢复;进一步证实自噬可能参与脊髓损伤后神经源性膀胱的自我修复,对于膀胱逼尿肌细胞有一定的保护作用。第三部分:自噬诱导剂雷帕霉素对大鼠脊髓损伤后神经源性膀胱的作用研究研究目的:观察自噬诱导剂雷帕霉素对大鼠脊髓损伤后神经源性膀胱的影响。研究方法:15只雄性wistar大鼠随机分为空白对照组,脊髓损伤组和雷帕霉素注射组。空白对照组只接受T10-T11水平的椎板切除术,而不损伤脊膜;脊髓损伤组和雷帕霉素注射组大鼠采用改良的Allen’ s法进行脊髓损伤的手术,造模完成后,雷帕霉素注射组大鼠腹腔注射雷帕霉素(2mg/kg),脊髓损伤组和空白对照组注射同等剂量的生理盐水。在术后1天、3天、5天、7天、9天、11天、14天进行运动评分、残余尿量、膀胱功能评分。使用BBB功能评定量表评定大鼠的运动功能情况;使用膀胱残余尿量和膀胱功能评分评估大鼠膀胱功能。结果:造模后,脊髓损伤组和雷帕霉素注射组的下肢功能丧失,而假手术组大鼠下肢运动功能正常。术后1天开始,脊髓损伤组和雷帕霉素注射组的下肢功能逐渐恢复,随时间呈上升趋势。其中,在术后3天、5天、9天雷帕霉素注射组的BBB评分较脊髓损伤组升高,差距有统计学意义(P<0.05),在术后11天、14天差距有显著统计学意义(P<0.01)。在术后7天、9天、11天、14天,雷帕霉素注射组的残余尿量相比脊髓损伤组减少,差距有统计学意义(P<0.05)。在术后1,3,5,7天,脊髓损伤组和雷帕霉素注射组膀胱功能评分无明显差异(P>0.05),在术后9,11,14天,雷帕霉素注射组膀胱功能评分较脊髓损伤组有所增加,差距有统计学意义(P<0.05)。结论:腹腔内注射雷帕霉素促进了脊髓损伤后大鼠的下肢运动功能和膀胱功能的恢复;自噬在脊髓损伤后神经源性膀胱中有所表达,并可能起到促进膀胱功能恢复的作用。