论文部分内容阅读
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是一种多功能的细胞因子,其主要作用是促进血管内皮细胞增殖和增加血管通透性,是肿瘤及正常组织血管生成的中心调控因素,以VEGF为靶点的肿瘤血管靶向性治疗成为近几年肿瘤治疗的新途径。RNAi是近年来新发展的一项反向遗传学技术,是一种研究基因功能的有力工具。斑马鱼作为一种重要的模式生物,被广泛用于胚胎的分子发育机制、疾病模型的构建以及药物筛选等研究中。然而在斑马鱼中运用RNAi技术进行基因功能研究是一个相对较新的领域,研究资料较少,并且目前进行的斑马鱼RNAi实验中,siRNA大都是通过化学方法或体外转录合成的。体外合成的siRNA在进入体内后会被降解而无法达到持久阻抑基因表达的目的。因此本研究旨在探讨VEGF特异性siRNA表达载体对斑马鱼VEGF基因的沉默作用,通过分析表型及相关细胞因子的变化,阐明VEGF对斑马鱼胚胎血管生成的影响及作用机制。研究通过计算机辅助设计软件,针对斑马鱼VEGF mRNA不同位点设计合成了4段含siRNA特异序列的DNA单链,经退火,克隆入pSilencer 4.1-CMV neo载体CMV启动子下游,构建了重组质粒pS1-VEGF、pS2-VEGF、pS3-VEGF及pS4-VEGF。通过显微注射的方法将载体导入1-2细胞期斑马鱼体内,于胚胎发育的48 h采用RT-PCR的方法检测VEGF基因的表达量,研究不同干扰序列对VEGF基因表达的干涉作用。结果显示,针对不同位点的表达载体对VEGF基因表达的抑制效率有显著差异。它们对VEGF mRNA的抑制率分别为80.5%,42.8%,12.5%,40.7%。通过筛选我们得到了一条具有高效抑制作用的载体pS1-VEGF,该载体的相应序列靶向斑马鱼两个主要异构体VEGF165和VEGF121的共有外显子序列。形态学检测结果显示,注射了pS1-VEGF的胚胎出现了心包膜水肿、血流速度减慢、循环红细胞堆积等症状。定量碱性磷酸酶染色显示,注射pS1-VEGF能够抑制斑马鱼胚胎新生血管的形成,当注射剂量为0.4 ng时,血管生成的抑制率为31.8%。NBT/BCIP血管染色显示,注射该载体后72 h,50%的斑马鱼肠下静脉、节间血管以及其它血管的发育受到不同程度的抑制。随着注射剂量的加大,血管发育受抑制的情况也随之加重,当注射剂量为1 ng时,只有心脏、头部及卵黄有血液循环。对干扰效果的特异性进行了研究,结果表明pS1-VEGF对斑马鱼内源基因胸苷酸合成酶(thymidylate synthase, TS)基因的表达没有明显的抑制作用。针对TS基因的shRNA表达载体及与斑马鱼没有同源性的对照载体对VEGF基因表达也没有明显的抑制作用。浓度梯度实验表明在0-1.2 ng的范围内干扰效果具有剂量依赖性。以胚胎整体原位杂交的方法检测质粒对VEGF基因受体NRP1基因表达的影响,发现VEGF特异性shRNA表达载体能够引起NRP1基因表达的降低,说明斑马鱼中VEGF所介导的血管生成作用至少在部分上是依赖于NRP通路所调节的。本研究工作为进一步研究斑马鱼基因功能、VEGF调控网络提供了一个快速、有效的手段,为阐明斑马鱼的血管生成机制提供了新的资料,为采用RNAi技术,以VEGF为靶点,以斑马鱼为模型对肿瘤进行基因治疗研究奠定了基础。