论文部分内容阅读
木质素是一种复杂致密、非常稳定的网状结构物质，也是非常难降解的天然芳香族聚合物，是地球上继植物多糖纤维素后第二大丰富的生物可再生资源，木质素的降解不仅关乎到造纸等行业的发展，同时也影响着可再生性能源利用的发展。白腐菌因其特有的细胞外降解酶系，是迄今为止最有效、最主要的木质素降解微生物，可彻底降解木质素成为CO2和水，白腐菌对木质纤维基质的降解在自然界的碳素循环中起着关键作用，可为其他微生物类群提供大量易于吸收的植物多糖类物质，同时白腐菌对木质素的降解也是以绿色、无污染的方式进行。偏肿革裥菌（Lenzites gibbosa）是我国东北林区常见的一种多孔菌科(Polyporaceae)白腐菌，生长在多种阔叶树的倒木、枯立木或活立木上，引起木材海绵状白色腐朽，也是一种生长速度较快、对木材和木质素分解能力较强的白腐菌，为了在分子层面上深入探索L.gibbosa降解木材和木质素的机理，本文利用HiSeq高通量测序技术对在木质和非木质条件下5个时间点的L.gibbosa菌体样本进行了转录组测序，对差异表达的基因进行了功能注释与富集分析，对降解木质素的关键酶基因和关键通路进行了挖掘，并利用荧光定量PCR对重要的关键基因进行了表达量验证，主要研究结果如下:
1、对在杨树木屑、水稻稻草、玉米秸秆3种不同木质纤维基质下的L.gibbosa木质素降解酶系统进行了酶活检测，结果表明3种不同木质纤维基质均能使L.gibbosa的漆酶(laccase)和锰过氧化物酶(MnP)活性提高，其中木屑对2种酶活的促进作用最为明显，稻草次之、秸秆最差，这与3者成分中木质素含量排序一致（木质素含量杨树木屑最高、水稻稻草次之、秸秆最低）。在30d的检测时间内，木屑组的2种酶活始终保持增长，而秸秆组和稻草组的酶活在试验后期出现波动甚至降低。以上数据揭示了L.gibbosa降解不同类型木质基质时酶的活性变化规律，为后续结合转录组测序数据联合分析找到木质素降解酶关键基因奠定了基础。
2、利用HiSeq高通量测序技术，对L.gibbosa在木质和非木质条件处理下的菌丝体进行了转录组测序与分析，从转录水平分析了L.gibbosa对木材与木质素降解的相关生物过程与代谢途径，结果表明L.gibbosa对木材与木质素的分解代谢与氧化还原反应过程密切相关、与木质素分解等生物过程密切相关，与碳代谢、芳香化合物降解等通路密切相关。本研究得到一条与木质素降解有关的COG分类关键类目Q类(Secondary metabolites biosynthesis，transport and catabolism)，一条木质素降解基因本体(Gene Ontology)关键类目(term):GO0046274（Lignin catabolic process），一条木质素降解关键通路ko01220(Degradation of aromatic compounds);通过表达量差异分析、差异表达基因的功能注释与分析，进一步得到一系列与木质素降解有关的关键酶及基因:NAD-P结合结构域蛋白酶、NADP-dependent alcohol dehydrogenase6（含GroES2域）、CYP450、Alcohol dehydrogenase（含GroES1域）、MnP2、MnP3、Versatile peroxidaseVPL1(VP,MnP10s)、MrP1、Laccase D、Laccase1、LiP9、LiP2等，为最终筛选L.gibbosa降解木质素的关键酶基因缩小了范围，为后续开展功能基因研究奠定了基础。
3、结合转录组测序与酶活检测数据，进行加权基因共表达网络构建与分析，得到与漆酶和MnP相关的2个基因模块，即turquoise模块和blue模块。利用统计学方法得到blue模块的82个关键基因(hub gene)，turquoise模块的261个hub genes，在这些hub genes中，利用COG、GO、KEGG注释分析，进一步缩小关键基因范围，结合转录组差异分析，确定了最终的11个关键基因:gene_14284、gene_11466、gene_11537、gene_3902、gene_5357、gene_6568、gene_713、gene_7760、gene_7855、gene_7857、gene_8611。
4、对筛选到的11个L.gibbosa木质素降解关键酶基因进行qPCR检测，选择木屑、稻草、秸秆3种底物处理，结果表明木屑组的基因表达差异最为显著，秸秆与稻草组次之，这些基因在不同类型的纤维基质中都差异表达，表明它们都为L.gibbosa降解木质素的关键基因。
5、通过RT-PCR技术克隆了L.gibbosa三条基因即mnp10s(VP)、laccase D、cyp450，分析得到mnp10s(VP)基因CDS全长1089bp，编码362个氨基酸，含有“ligninase”保守结构域，属于plant peroxidase超家族蛋白;laccase D基因CDS全长1608bp，编码535个氨基酸，含有“CouRO1Tv-LCC like”和“CouRO3Tv-LCC like”两个保守结构域，属于Cupredoxin超家族蛋白;cyp450-up1基因CDS全长2001bp，编码666个氨基酸，属于P450超家族蛋白。
以上研究为完整揭示偏肿革裥菌降解木材与木质素的机理奠定了重要的分子基础。
1、对在杨树木屑、水稻稻草、玉米秸秆3种不同木质纤维基质下的L.gibbosa木质素降解酶系统进行了酶活检测，结果表明3种不同木质纤维基质均能使L.gibbosa的漆酶(laccase)和锰过氧化物酶(MnP)活性提高，其中木屑对2种酶活的促进作用最为明显，稻草次之、秸秆最差，这与3者成分中木质素含量排序一致（木质素含量杨树木屑最高、水稻稻草次之、秸秆最低）。在30d的检测时间内，木屑组的2种酶活始终保持增长，而秸秆组和稻草组的酶活在试验后期出现波动甚至降低。以上数据揭示了L.gibbosa降解不同类型木质基质时酶的活性变化规律，为后续结合转录组测序数据联合分析找到木质素降解酶关键基因奠定了基础。
2、利用HiSeq高通量测序技术，对L.gibbosa在木质和非木质条件处理下的菌丝体进行了转录组测序与分析，从转录水平分析了L.gibbosa对木材与木质素降解的相关生物过程与代谢途径，结果表明L.gibbosa对木材与木质素的分解代谢与氧化还原反应过程密切相关、与木质素分解等生物过程密切相关，与碳代谢、芳香化合物降解等通路密切相关。本研究得到一条与木质素降解有关的COG分类关键类目Q类(Secondary metabolites biosynthesis，transport and catabolism)，一条木质素降解基因本体(Gene Ontology)关键类目(term):GO0046274（Lignin catabolic process），一条木质素降解关键通路ko01220(Degradation of aromatic compounds);通过表达量差异分析、差异表达基因的功能注释与分析，进一步得到一系列与木质素降解有关的关键酶及基因:NAD-P结合结构域蛋白酶、NADP-dependent alcohol dehydrogenase6（含GroES2域）、CYP450、Alcohol dehydrogenase（含GroES1域）、MnP2、MnP3、Versatile peroxidaseVPL1(VP,MnP10s)、MrP1、Laccase D、Laccase1、LiP9、LiP2等，为最终筛选L.gibbosa降解木质素的关键酶基因缩小了范围，为后续开展功能基因研究奠定了基础。
3、结合转录组测序与酶活检测数据，进行加权基因共表达网络构建与分析，得到与漆酶和MnP相关的2个基因模块，即turquoise模块和blue模块。利用统计学方法得到blue模块的82个关键基因(hub gene)，turquoise模块的261个hub genes，在这些hub genes中，利用COG、GO、KEGG注释分析，进一步缩小关键基因范围，结合转录组差异分析，确定了最终的11个关键基因:gene_14284、gene_11466、gene_11537、gene_3902、gene_5357、gene_6568、gene_713、gene_7760、gene_7855、gene_7857、gene_8611。
4、对筛选到的11个L.gibbosa木质素降解关键酶基因进行qPCR检测，选择木屑、稻草、秸秆3种底物处理，结果表明木屑组的基因表达差异最为显著，秸秆与稻草组次之，这些基因在不同类型的纤维基质中都差异表达，表明它们都为L.gibbosa降解木质素的关键基因。
5、通过RT-PCR技术克隆了L.gibbosa三条基因即mnp10s(VP)、laccase D、cyp450，分析得到mnp10s(VP)基因CDS全长1089bp，编码362个氨基酸，含有“ligninase”保守结构域，属于plant peroxidase超家族蛋白;laccase D基因CDS全长1608bp，编码535个氨基酸，含有“CouRO1Tv-LCC like”和“CouRO3Tv-LCC like”两个保守结构域，属于Cupredoxin超家族蛋白;cyp450-up1基因CDS全长2001bp，编码666个氨基酸，属于P450超家族蛋白。
以上研究为完整揭示偏肿革裥菌降解木材与木质素的机理奠定了重要的分子基础。