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第一部分分化因子与抗分化因子在神经管发育缺陷疾病中的表达研究第一节分化因子与抗分化因子在神经管发育缺陷疾病中的表达研究目的:对比研究抗分化基因HA117及其相关促分化调控基因在脑膜脑膨出和正常脑组织中的相对表达水平。方法:收集15例脑膜脑膨出手术切除组织,5例为脑外伤清创术切除的脑组织为正常对照。1.q RT-PCR检测HA117、DPF3、RGS6、STRA6、RARα、CYP26-A1的m RNA相对表达水平;2.Western blot方法检测DPF3、RGS6、STRA6、RARα、CYP26-A1蛋白相对表达水平。结果:1.在脑膜脑膨出组织较正常对照组织中HA117 m RNA表达水平无明显差异(P>0.05);DPF3、RGS6 m RNA表达水平显著升高(P﹤0.01);STRA6、Cyp26a1 m RNA表达水平显著升高(P﹤0.01);RXRαm RNA表达水平显著升高(P﹤0.05)。2.WB结果显示:在脑膜脑膨出组织较正常对照组织中DPF3、RGS6蛋白表达水平显著升高(P﹤0.01);STRA6、Cyp26a1、RARA蛋白表达水平显著升高(P﹤0.01)。结论:促分化基因DPF3、RGS6的过表达,过度活化的ARTA信号通路促分化相关基因STRA6、RARA、Cyp26a1影响神经管神经脊细胞的正常分化,影响胚胎发育过程中神经管的闭合,导致NTDs的发生。第二节分化因子与抗分化因子基因在NTDs C57小鼠模型中的表达研究目的:对比研究抗分化基因HA117及其相关促分化调控基因在NTDs小鼠模型和正常小鼠脑组织中的相对表达水平。方法:1.大剂量ARTA灌胃刺激孕鼠,筛选NTDs表型的子代胎鼠;2.q RT-PCR检测HA117、DPF3、RGS6、STRA6、RARα、CYP26-A1m RNA在NTDs胎鼠脑组织和正常胎鼠脑组织的表达水平。结果:1.成功构建NTDs动物模型,与正常胎鼠对比NTDs胎鼠后脑出现异常,可见血管瘤样改变,神经管前段发育连续性中断,神经管表面皮肤薄弱,尾部可见发育异常;2.q PCR结果显示,在灌胃组胎鼠脑组织较对照胎鼠脑组织组织中HA117 m RNA表达水平显著升高(P﹤0.01);DPF3、RGS6 m RNA水平表达无明显差异(P>0.05);STRA6、RARα、Cyp26a1 m RNA表达水平显著增高(P﹤0.05)。结论:大剂量ARTA刺激孕鼠导致子代鼠发生NTDs的发生机制可能为:ARTA刺激non-coding RNA HA117的过表达抑制正常分化,刺激STRA6、RARA、CYP26A1基因的过表达导致异常分化而产生。第二部分分化因子与抗分化因子在神经胶质瘤中的表达研究第一节分化因子与抗分化因子在神经胶质瘤中的表达研究目的:对比研究抗分化基因HA117及其相关促分化调控基因在神经胶质瘤和正常脑组织中的相对表达水平。方法:收集25例神经胶质细胞瘤患儿手术切除组织,5例为脑外伤清创术切除的脑组织为正常对照。1.q RT-PCR检测HA117、DPF3、RGS6、STRA6、RARα、CYP26-A1的m RNA相对表达水平;2.Western blot方法检测DPF3、RGS6、STRA6、RARα、CYP26-A1蛋白相对表达水平。结果:1.q RT-PCR检测结果显示:在GBM组织中HA117 m RNA表达水平显著升高(P﹤0.01);DPF3 m RNA水平显著降低(P﹤0.01);Cyp26a1 m RNA表达水平显著降低(P﹤0.01);STRA6、RARα、RGS6 mRNA表达水平无明显差异(P﹥0.05)。2.WB结果显示:在GBM组织中DPF3、RGS6蛋白表达水平显著降低(P﹤0.05);RGS6、RARα、Cyp26a1蛋白表达水平显著降低(P﹤0.01)(P﹤0.01)。结论:HA117基因在胶质瘤组织中较正常对照组织呈明显高表达,其下游DPF3基因RNA及蛋白呈低表达,ARTA的代谢相关STRA6、RARA、Cyp26a1 m RNA及蛋白水平呈低表达,这些基因低表达水平参与维持肿瘤细胞的干性,导致其恶性及耐药的生物学行为第二节靶向干扰抗分化基因HA117的表达逆转U251细胞耐药机制的研究目的:探讨抗分化基因no-coding RNA HA117参与胶质瘤耐ARTA基因网络调控机制。方法:1.建立HA117-RNAi U251细胞系,验证其干扰效果及慢病毒对细胞凋亡的影响;2.q RT-PCR检测U251细胞、LV-vector U251、HA117-RNAi U251三组细胞中DPF3、RGS6、STRA6、RARα、CYP26-A1的m RNA表达水平;3.MTT法检测不同浓度替莫唑胺(TMZ)及TMZ+0.5μm ARTA对三组细胞抑制率的影响;4.Western blot方法检测三组细胞DPF3、RGS6、STRA6、RARα、CYP26-A1蛋白表达水平。结果:1.成功构建HA117-RNAi U251细胞系,干扰后HA117水平明显降低,流式技术检测慢病毒对U251细胞凋亡无明显作用;2.q RT-PCR检测结果显示:HA117-RNAi U251组DPF3 m RNA水平显著增高,STRA6、CYP26-A1 m RNA水平显著增高P﹤0.01,RGS6、RARαm RNA水平无显著差异P>0.05;3.MTT检测细胞耐药性结果显示:正常U251细胞与LV-vector U25相比无差异,HA117-RNAi U251与正常U251细胞、LV-vector U25相比对TMZ敏感性提高3倍,加0.5um ARTA后对TMZ敏感性较HA117-RNAi U251单用TMZ对TMZ的敏感性又提高4倍;4.WB结果显示:DPF3、CYP26-A1蛋白水平显著增高P﹤0.01,RGS6、STRA6、RARα蛋白水平无显著差异P>0.05。结论:1.抗分化基因HA117的高表达参与了U251对ARTA和常规化疗药物的耐受,其机制为下调其下游促分化基因DPF3,远程抑制促分化基因Cyp26a1影响ARTA的代谢来实现;2.HA117可作为临床逆转神经胶质瘤耐药的分子靶向干扰靶点。第三部分青蒿琥酯通过抑制促血管生成因子HIF-1α-VEGF-A治疗血管瘤的机制研究目的:确定一种新的治疗幼儿血管瘤的药物—青蒿琥酯,并深入研究其促进血管瘤分化的作用机制。方法:1、体外培养鼠源性血管内皮细胞(EOMA)应用噻唑蓝(MTT)实验检测不同浓度组青蒿琥酯对EOMA细胞24h、48h、72h抑制率,并确定药物最佳抑制浓度;2、流式细胞技术检测最佳抑制浓度组对EOMA细胞早期凋亡的影响;3、Transwell检测最佳抑制浓度作用28h对EOMA迁移侵袭能力的影响;4、q RT-PCR检测对照组EOMA和最佳抑制浓度作用EOMA24h、48h、72h后VEGFA、VEGFR1、VEGFR2、HIF-1α、基因表达水平变化;5、Western-Blot检测对照组EOMA和最佳抑制浓度作用EOMA 24h、48h、72h后VEGFA、VEGFR1、VEGFR2、HIF-1α、capases3蛋白表达水平变化;6、建立血管瘤裸鼠模型,局部注射青蒿琥酯,隔日观察并记录瘤体大小变化情况,并与平阳霉素对比研究。结果:1、青蒿琥酯对EOMA细胞的抑制率呈药物浓度、时间依赖性,其最佳抑制浓度IC50值在300ug/ml左右;2、青蒿琥酯能够促进EOMA细胞凋亡,P<0.05;3、青蒿琥酯能够明显抑制EOMA侵袭能力,对照组与实验组相比,P<0.05;4、对照组与实验组作用24h、48h、72h后VEGFA、VEGFR1、VEGFR2、HIF-1αm RNA表达水平逐渐降低(P<0.05);5、对照组与实验组比较VEGFA、VEGFR2、HIF-1α蛋白表达水平逐渐降低(P<0.05),Capases3蛋白表达水平逐渐增高(P<0.05),VEGFR1蛋白表达无变化;6、动物实验平均血管瘤大小结果:组内差异P>0.05,阴性对照组与阴性注射对照组组间差异P>0.05,注射治疗组与阴性注射对照组组间差异P<0.05,注射治疗组与阴性对照组组间差异P<0.05,注射治疗组与平阳霉素对照组组间无差异P>0.05。结论:通过细胞实验及动物实验证实青蒿琥酯通过促进EOMA的凋亡,抑制HIF-1α-VEGF-A促血管生成作用,达到治疗血管瘤的目的,其疗效与临床常用的平阳霉素效果相当。