前言：　　支气管肺发育不良(BPD)是与早产儿相关的主要并发症之一，它是神经发育损害的危险因素，也是生长发育迟缓的高危因素。近年来，随着产前糖皮质激素、肺表面活性物质及肺保护性通气策略的应用，早产儿的存活率逐渐增加，伴随而来的是与早产相关的BPD的发生率居高不下。2012年的一项临床研究证实，在极低出生体重儿(出生体重＜1000g)中，BPD的发病率为52％。因此，为了改善早产儿的生存质量，如何预防和治疗BPD成为目前函待解决的问题。　　最早的BPD的概念是1967年Northway等人提出，现在称为“经典”或“老”BPD。这些患儿从出生时起就存在着严重的呼吸衰竭，经历了长时间吸入高浓度氧及侵入性机械通气，最终发展为慢性呼吸衰竭。其病理学改变严重，包括肺气肿、肺不张、肺纤维化、严重的气道上皮的鳞状化生及肺脉管系统的平滑肌增生肥大等。这些病理改变与严重的呼吸衰竭、肺动脉高压及肺源性心脏病密切相关。与病理学改变相对应，“经典/老”BPD有特征性的胸部放射学表现，包括肺充气过度、肺不张、弥漫的肺纤维化等。这些BPD患儿有严重的呼吸道症状及典型的胸片表现，因此诊断并不困难。随着肺表面活性物质及肺“温和”通气策略（如允许性高碳酸血症）的应用，BPD的临床表现更轻，病理及胸部放射学与以往“老”BPD相比明显不同。这些较“轻”的BPD的病理学改变主要包括:肺液体增加、弥漫性的炎症反应、肺分隔明显减低和血管发育受损。而胸部放射学经常仅仅表现为肺野模糊（反应了肺容量减少或肺内液体增加），偶尔也会出现肺段致密区、肺不张及肺炎浸润的表现，但没有“经典/老”BPD的肺过度充气的表现。　　肺泡发育障碍是“新”BPD的主要病理改变，有关其发病机制并不是很清楚。我们课题小组以往的研究在肺泡上皮细胞中发现了间质细胞的标志物，由此我们想到了上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)。EMT是指上皮细胞经过转分化变成间质细胞。目前，已经发现多种上皮细胞能够发生EMT，如肝细胞、肾小管上皮细胞、人的肺泡Ⅱ型上皮细胞等。是否在新生鼠BPD模型中存在着EMT还不得而知。本研究通过体内、外实验证实是否在BPD中存在这一过程，并且寻找其发生机制。EMT的发生机制复杂，涉及到许多细胞因子和转录因子的调控。目前Runx3在EMT发生过程中的作用正在日益受到人们的关注。目前的研究已经证实了Runx3是肺发育中的重要影响因素。近来，Lee等证实了Runx3在肺发育EMT过程中的作用。他们的研究结果表明:在Runx3敲除的鼠肺内存在着异常的EMT过程，导致肺泡发育异常。本研究以此为基础，在建立此BPD模型的基础上，结合细胞培养技术，通过形态学观察、蛋白和基因表达的测定，试图证实Runx3能够调节肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar epithelial typeⅡ cells(AT2)经历EMT过程，从而为BPD的防治提供了新的理念。　　材料与方法：　　一、实验分组及标本的采集　　1、动物模型的建立及肺组织标本的采集　　所用的实验动物新生Wistar大鼠由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供。将生后12h内的新生鼠随机分为两组，一组为对照组，另一组为BPD组。BPD组的新生鼠生后即置于氧箱中，持续输入氧气，维持氧浓度为0.90，持续监测氧浓度（美国OM—25ME型测氧仪监测），用钠石灰吸收CO2，使其浓度小于0.5％，温度为25-27℃，湿度50％-70％，每天开箱10分钟，添加水及饲料，更换垫料，并每天与空气对照组互换代母鼠以避免因氧中毒而致护理能力降低;对照组置于空气中（氧浓度21％），具体方法及控制因素同空气组。　　实验开始后的第1、3、7、14、21d，分别从每组随机抽取8只新生鼠，提取肺组织。腹腔内注射10％的水合氯醛(3ml/kg)进行麻醉，然后打开胸腔，分离肺组织。左肺置于4％的多聚甲醛中进行固定，用于HE染色和免疫荧光。右肺放在液氮中用于mRNA和western-blotting检测。另外，从左肺组织切取1mm3大小的肺组织并固定于2.5％的戊二醛中，用于透射电镜观察。　　2、原代肺泡2型上皮细胞的分离和纯化　　按照我们以往的建立的方法分别提取两组的第1、3、7、14、21d的肺泡2型上皮细胞。收集纯化的AT2细胞，-80度保存用于western-blotting、 Real-Time PCR检测;AT2细胞爬片用于肺泡2型细胞的抗原鉴定。　　3、RLE-6TN细胞系培养　　RLE-6TN细胞系购自美国ATCC公司。Runx3过表达质粒和Runx3干扰siRNA由上海吉凯基因构建并合成。正常培养的RLE-6TN细胞系，待细胞融合达70％时进行基因干扰和质粒转染，所用转染试剂为lipo2000。　　根据细胞的干预条件，将实验分为五组:　　对照组:正常RLE-6TN细胞单层。　　Runx3组:Runx3过表达的RLE-6TN细胞单层，正常RLE-6TN细胞单层与Runx3过表达质粒作用72h。　　siRunx3组:Runx3基因沉默RLE-6TN单层，正常RLE-6TN单层与siRunx3作用72h。　　TGF-β1组:用2.5ng/ml的TGF-β1刺激RLE-6TN细胞单层，作用48h。　　TGF-β1+Runx3组:正常RLE-6TN细胞单层与Runx3过表达质粒作用24h后，再加入2.5ng/ml的TGF-β1刺激RLE-6TN细胞单层，继续作用48h。　　二、实验方法及检测指标　　（一）BPD病理形态学研究　　1、光镜观察:肺组织切片进行常规HE染色，光镜下动态观察肺组织的病理改变。　　2、放射状肺泡计数(radial alveolar counts，RAC)　　3、肺泡间隔厚度的测量　　（二）肺组织中EMT现象的检测　　1、免疫荧光双标　　用免疫荧光双标的方法，同时标记AT2的标志物肺表面活性蛋白C(surfact antprotein C，SPC)和间质细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，观察肺组织中肺泡2型上皮细胞的EMT现象。同时计算肺泡发育指标α-SMA阳性肺泡继发性分隔的百分率。　　2、透射电镜(transmission electron microscopy，TEM)，观察发生EMT的AT2的超微结构改变。　　3、western-blot和real-time PCR技术检测肺组织中SPC、α-SMA、E-钙粘蛋白(E-cad)、N-钙粘蛋白(N-cad)的表达。　　（三）原代提取的AT2中EMT标志物的检测(SPC、α-SMA、E-cad、N-cad)　　采用western-blot和real-time PCR技术，检测两组不同时间点原代培养的AT2细胞中SPC、α-SMA、E-cad、N-cad的基因及蛋白的表达。　　（四）肺组织及原代提取的AT2细胞中Runx3的表达及与肺发育指标的相关性分析　　1、免疫组化(immunohistochemisty，IHC)，观察肺组织中Runx3的表达　　2、采用western-blot和real-time PCR技术，检测两组不同时间点肺组织和原代培养的AT2细胞中Runx3的基因及蛋白的表达。　　3、Spearman相关性分析，分析Runx3与肺泡发育指标的相关性。　　（五）Runx3的表达改变对RLE-6TN细胞EMT的影响　　1、通过western-blot和real-time PCR技术，进行Runx3基因沉默及过表达的效果的验证。　　2、通过SPC和α-SMA的双标免疫荧光，分析各组细胞的EMT现象　　3、透射电镜观察各组细胞的超微结构改变　　4、通过western-blot和real-time PCR技术，分析各组EMT相关指标的基因和蛋白的表达改变(SPC、α-SMA、E-cad、N-cad)。　　三、统计学分析　　应用SPSS11.5.统计软件进行统计学处理，数据以均值±标准差((x)±s)表示，单因素多水平比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，两样本均数间比较采用独立样本t检验（independent t-test）或成对样本t检验。相关分析采线性相关性分析(Spearman)，结果以P＜0.05有意义。　　结果：　　一、两组肺组织形态学改变及RAC值、肺泡间隔厚度及α-SMA阳性的继发性肺分隔百分率的比较　　（一）、肺组织病理学改变　　对照组第1d，肺泡样结构不规则，肺泡隔数量少，和模型组相比没有明显的形态学不同。在对照组第3d，肺泡和肺泡隔的数量增加，肺泡隔变薄。而在模型组第三天，肺泡隔增厚。在对照组第7d，肺泡和肺泡隔数量明显增加，肺泡隔继续变薄，肺泡大小一致。而在模型组第7d，肺泡数量减少，肺泡腔变大。在对照组14d和21d，肺泡变得更加规则，肺泡大小一致，肺泡和肺泡隔更加密集。在模型组14d和21d，肺泡腔明显增大，肺泡隔明显增厚，肺泡数量减少，肺泡的正常结构消失。　　（二）两组RAC比较　　第1、3d两组之间物显著性差异。而对照组第7、14、21d的RAC值明显高于模型组，差异有统计学意义(P＜0.01);并且对照组RAC值随生后的日龄而逐渐增加，第7、14、21d的RAC值明显高于第1天(P＜0.01)。　　（三）肺泡间隔厚度比较　　对照组肺泡间隔厚度随日龄的增加逐渐变薄;实验组肺泡间隔逐渐增宽。1d和3d对照组同实验组比较无明显差异;7d、14d和21d时实验组组肺泡间隔较同期对照组明显增宽，差异显著（P＜0.01）。　　（四）、α-SMA阳性的继发性肺分隔百分率的比较　　通过α-SMA的免疫荧光，发现在两组肺组织中第1、3d的表达无明显差异。对照组，从第7d开始，α-SMA的表达逐渐增加，主要表达于继发性肺分隔的顶端。而模型组α-SMA的表达，第14d、21d主要表达于肺间质。第7、14、21d时间点α-SMA阳性的继发性肺泡分间隔的百分率，BPD模型组明显低于对照组。　　二、肺组织中EMT相关的免疫荧光双标(SPC和α-SMA)　　在对照组，红色的SPC荧光和绿色的α-SMA荧光散在分布于肺泡壁和肺泡隔中，但没发现两种标记物共表达的细胞。在模型组第1、3d，也没发现细胞中标记物的共表达现象。在模型组第7d，一些细胞的胞浆中可见橙色的SPC和α-SMA共表达的荧光，在第14d和21d，可见橙色荧光强度较第7d增强。　　三、肺组织AT2的超微结构改变(TEM)　　用透射电镜观察AT2的超微结构改变。在对照组，可见正常的肺泡2型细胞呈立方型，细胞顶端有微绒毛，细胞浆内可见特征性的板层小体。在模型组的第1、3d，没有发现与EMT形态学相关的肺泡2型上皮细胞。在模型组第7d，可见部分肺泡2型细胞内的板层小体空泡化，特征性的束状的actin微丝分布于肺泡2型细胞的胞浆中。　　四、肺组织中EMT相关蛋白及mRNA的表达改变(SPC、α-SMA、E-cad、 N-cad)　　（一）、肺组织中EMT相关蛋白的表达改变　　在第1、3d时，两组比较SPC、α-SMA、E-cad、N-cad蛋白的表达均无明显差异。模型组14、21d，SPC、α-SMA蛋白的表达明显高于对照组;第7、14、21d，模型组E-cad蛋白的表达均低于对照组，而N-cad蛋白的表达均高于对照组。　　（二）、肺组织中EMT相关蛋白mRNA的表达改变　　第1、3d时，两组间比较SPC、α-SMA、E-cad、N-cad mRNA无明显差异。两组之间比较，模型组14、21d，SPC mRNA的表达明显高于对照组。第7、14和21d，模型组的α-SMA mRNA、N-cad mRNA的表达均高于对照组，E-cadmRNA的表达水平明显低于对照组。　　五、原代提取的肺泡2型上皮细胞中EMT相关蛋白mRNA及蛋白的表达改变　　（一）、原代提取的AT2中EMT相关蛋白的表达改变　　第1、3d时，两组间比较EMT相关的蛋白表达无明显差异。模型组第7、14、21d，上皮细胞标志物SPC、E-cad蛋白的表达均低于对照组，而间质细胞标记物α-SMA、N-cad蛋白的表达均高于对照组。　　(二)、原代提取的AT2中EMT相关蛋白mRNA的表达改变　　与蛋白的表达结果类似，第1、3d时，两组间比较EMT相关蛋白mRNA的表达无明显差异。模型组第7、14、21d，上皮细胞标志物SPC、E-cad的mRNA表达均低于对照组，而间质细胞标记物α-SMA、N-cad mRNA的表达均高于对照组。　　六、肺组织中Runx3蛋白和mRNA的表达改变　　（一）、免疫组织化学技术分析Runx3蛋白的表达　　在两组肺组织中，所选取的不同时间点，均发现Runx3的表达。对照组Runx3与第7d开始表达增加，持续至21d。而BPD模型组肺组织，从第7天开始，Runx3的表达减少　　（二）、肺组织中Runx3蛋白及mRNA表达改变　　第7、14和21d，模型组的Runx3蛋白和mRNA的表达均低于对照组。　　七、原代提取的肺泡2型上皮细胞中Runx3蛋白及mRNA的表达　　第7、14和21d，模型组的Runx3蛋白及mRNA的表达均低于对照组。　　八、肺组织中Runx3蛋白表达与肺发育指标的相关性分析　　Runx3蛋白的表达与RAC、α-SMA阳性的继发性肺泡分间隔的百分率正相关，与肺泡间隔厚度负相关。　　九、Runx3的表达改变对RLE-6TN细胞系EMT的影响　　（一）、RLE-6TN细胞中Runx3基因沉默及过表达效果的验证　　Western-blotting和Real-time PCR技术检测RLE-6TN细胞Runx3基因沉默及过表达效果。结果表明，Runx3基因沉默后48小时，Runx3的蛋白和mRNA的表达即开始减低，效果持续72小时;而Runx3质粒转染48小时后，Runx3的mRNA及蛋白的表达即开始增加，并持续至转染后的72小时。　　（二）、各组细胞EMT标志物(SPC、α-SMA)双标免疫荧光结果　　对照组和Runx3组RLE-6TN细胞，可见SPC表达于细胞浆，未见α-SMA的表达;TGF-β1组和siRunx3组可出现间质细胞标记物α-SMA的表达;TGF-β1+Runx3组， SPC的表达类似于对照组，而α-SMA的表达不明显。　　（三）、各组细胞的超微结构改变　　在TGF-β1和siRunx3组细胞中，TEM发现了间质细胞特征性标志物actin微丝，而在对照组细胞、Runx3组、TGF-β1+Runx3组可见正常的AT2的结构。　　（四）、各组细胞EMT相关蛋白及mRNA结果的检测　　1、对照组RLE-6TN细胞，表达一定量的SPC和E-cad，而未见α-SMA及N-cad的表达.　　2、siRunx3组，Runx3沉默72小时的RLE-6TN细胞，出现间质细胞标志物α-SMA及N-cad的表达，而SPC和E-cad明显减低，细胞发生了EMT。　　3、Runx3组，Runx3过表达72小时的RLE-6TN细胞，SPC和E-cad的表达无明显改变，而α-SMA及N-cad的表达微量。　　4、TGF-β1组，与siRunx3组结果类似，出现间质细胞标志物α-SMA及N-cad的表达，而SPC和E-cad明显减低。　　5、TGF-β1+ Runx3组，与对照组结果类似，可见一定量的SPC和E-cad的表达，而间质细胞标志物表达微量。　　结论：　　1.本研究分别在组织及细胞水平，证实在BPD发生、发展中存在肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞的转化现象，表明2型上皮细胞直接损伤并非影响BPD肺泡化的唯一机制。　　2.在BPD的肺泡发育障碍阶段，作为转录因子的Runx3，不论基因还是蛋白的表达水平均明显下调，且其表达减低的时间恰是发生EMT的关键时期，并且与肺泡发育指标密切相关，这说明BPD模型中，Runx3可能通过影响EMT促进了BPD的发生。　　3.通过建立Runx3基因低表达和过表达的细胞模型，进一步验证了Runx3是调控EMT的关键基因，从而揭示了BPD中Runx3表达下调介导的EMT可能是影响肺泡化的又一关键机制。