众所周知,现已发现的人类离子蛋白通道分为的膜电压门控、配体激活和机械压力感应等离子通道三大类。近几年来,研究发现瞬时受体电位(transient receptor potential, TRP)通道是一组受多种因素调节且广泛分布于人体的新型离子通道,但该通道激活与失活机制、何种方式以及通道确切功能尚不清楚。目前发现的TRP通道广泛存在于人体多种组织器官,包括心脏、血管床、肺、神经系统、肾脏、肠及前列腺等,其中一种叫Melastatin相关的亚家族TRPM在心脏中分布较广,是目前所知仅有的两个具有独特内部激酶功能蛋白结构的通道之一(另一个为TRPM6)。遗憾的是,目前人们对TRPM7通道自身的基础电生理特性和激活因子仍不甚了解,临床报道的TRPM7突变所导致遗传性低镁血症及继发性低钙血症(HSH)中TRPM7的病理作用及其调节机制至今无法完全解释。研究表明,TRPM7的特性在于它既是离子通道又是蛋白激酶,尽管生理状态下作为激酶的功能还未完全清楚,然而它在维持细胞Mg2+稳态、缺氧性细胞死亡、细胞增殖与发育及异常Mg2+吸收所致疾病的发病等方面发挥重要作用。目前困扰研究者的是,在生理状态下,如何找到诱发或增强TRPM7离子通道电流的相对特异性的内源性物质是当前紧迫的课题。过去报道的调节因素有Mg2+离子、卡巴胆碱(CCh)和磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)等,但TRPM7所介导的主要阳离子H+的内流及其竞争机制尚未见报道,而弄清这个问题对于了解TRPM7在在体心脏缺血酸中毒等组织损伤状态下的病理作用,以及明确影响TRPM7离子选择性的孔区关键氨基酸残基,为药理干预TRPM7的病理生理作用提供依据。既往关于心脏离子通道的研究大多集中在心肌细胞,鲜有关于心脏成纤维细胞(CFs)离子通道及其病理生理学作用的报道。然而随着近年研究显示,占心脏细胞总数约三分之二的CFs,包括细胞外基质成分(ECM)不仅仅是细胞的骨架作用,更重要的是主动参与了调节心脏功能的病理生理作用,并且可能与心肌肥厚、心肌梗死后、心力衰竭、心律失常以及猝死等相关疾病的心脏纤维化重构过程密切相关。现有电生理研究表明,三种离子通道中,CFs上并不存在电压门控依赖性离子通道[16],机械张力或牵拉刺激被证实可诱导CFs膜电位变化(MIP)与钙离子信号。但在多数病理生理状态下,究竟是通过哪种离子通道介导了CFs细胞内外的阳离子流特别是Ca2+内流,并触发胞内钙信号转导,介导CFs细胞的病理生理功能,尚缺乏相关的实验研究和结论。为了了解TRPM7通道结构和功能的关系,以及它在生理和病理状态下的激活和失活机制,并进一步深入研究其在CFs细胞中的生理作用,明确TRPM7通道在CFs中的可能作用及其参与心脏纤维化的分子机制,本研究观察了TRPM7通道在小鼠心脏成纤维细胞上的表达,以及重要阳离子Ca2+、Mg2+通透性,H+离子在TRPM7孔道S5和S6之间的氨基酸残基结合部位,试图明确TRPM7是否就是CFs细胞TRPM7样电流(TRPM7L)的分子基础,钙内流是否是TRPM7L电流主要成分,而且参与TGFβ1导致心肌组织纤维化的病理生理过程。整个实验共分为三部分。第一部分：H+对TRPM7通道离子通透特性的影响目的：TRPM7通道的激活机制及激活因子尚不十分清楚,本实验研究酸性环境下TRPM7通道电生理特性的变化及其可能机制。方法：(1)培养转染了TRPM7基因的HEK-293细胞；(2)应用全细胞膜片钳技术观察不同pH值条件下及在不同离子成份、不同离子浓度的溶液中TRPM7通道内外向电流幅值的变化和通道电导系数的变化。结果：(1)H+使TRPM7通道的内向电流幅值显著增加并具有浓度依赖性；(2)该效应是通过竞争TRPM7通道孔内的Ca2+和Mg2+的结合位点实现的。结论：(1)TRPM7对H+敏感是其显著生理特征之一,低pH值使TRPM7的内向电流显著增加,说明它在酸中毒条件下可能具有重要的病理生理作用；(2)H+与Ca2+、Mg2+竞争TRPM7通道孔区上的结合位点从而引起单价阳离子电流幅值增加是TRPM7在酸性环境下内向电流增加的机制。第二部分：TRPM7在小鼠心脏成纤维细胞中的表达目的：本实验旨在明确TRPM7是否在CFs细胞丰富表达,并且是TRPM7L电流的分子基础,探讨CFs细胞与多种纤维化疾病的可能关系。方法：(1)制备小鼠心梗模型并分离CFs细胞,培养传代并采用SiRNA技术处理细胞；(2)采用多克隆抗体免疫组织化学技术确定CFs细胞上TRPM7通道的表达；(3)全细胞及单通道膜片钳技术记录CFs细胞TRPM7L电流的特征,并观察在不同离子成份、pH值溶液及LPA、2-APB作用下通道内外向电流幅值的变化；(4)钙荧光显像技术观察H+对CFs细胞Ca2+内流的影响。结果：(1)TRPM7蛋白在CFs细胞上表达丰富；(2)TRPM7L通道电生理特性均与TRPM7通道一致；(3)酸性pH值等使CFs细胞Ca2+内流增加；(4)SiRNA处理后,TRPM7L的mRNA水平明显下降,伴通道电流幅值显著减少(p<0.01)。结论：(1)TRPM7是CFs细胞中TRPM7L电流的分子基础；(2)TRPM7L是CFs中钙内流主要媒介。第三部分：TRPM7在小鼠心肌梗死后及TGFβ1介导的心肌纤维化形成中的作用目的：观察TRPM7L在致纤维化因子TGFβ1作用下其电流幅值变化和对CFs胶原生成的影响,从而探讨TRPM7对CFs介导心脏纤维化的潜在病理生理作用。方法：(1)采用RT-PCR技术观察SiRNA感染组与对照组细胞分别在经处理后的TRPM7L的mRNA表达水平和电流幅值；(2)心肌梗死模型制作及其后CFs电流变化观察；(3)不同浓度TGFβ1对CFs细胞总胶原含量的影响。结果：(1)TGFβ1处理组CFs细胞TRPM7的mRNA丰度、电流幅值均显著增加(p<0.01)；(2)致纤维化因素心肌梗死后缺血等使TRPM7介导的CFs细胞内向Ca2+电流增加；(3)TGFβ1处理组CFs细胞的总胶原含量亦较对照组细胞显著增加(p<0.01)。结论：重要致纤维化相关病理因素TGFβ1和酸中毒等通过调节TRPM7L介导的Ca2+信号机制介导了CFs细胞下游的各种病理生理功能,在心脏纤维化形成的病理生理过程中起到重要作用。