论文部分内容阅读
目的:胃癌（Gastric cancer,GC）是世界上第三大恶性肿瘤,其5年生存率只有20%。GC的早期确诊、治疗方法有限,预后不佳。血管内皮生长因子A（Vascular endothelial growth factor A,VEGFA）已被确定为治疗晚期GC的关键靶点。近年来,传统中草药因其低毒性而日益受到重视,将其作为一种辅助疗法来治疗GC。据文献报道,1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖主要存在于白蔹中,属多酚类化合物,近年来研究表明PGG在抗癌方面显示出巨大的潜力,例如肝癌、乳腺癌及结直肠癌。然而,PGG治疗GC的潜在疗效和药理机制尚未见报道。本研究旨在探讨白蔹提取物PGG的分子特征,以及其靶向VEGFA介导GC细胞凋亡与自噬的分子机制,为GC防治提供新型策略。方法:（1）结合中药系统药理数据库和分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP）,应用计算机辅助药品设计（Computer-Aided Drug Design,CADD）中打分函数排序筛选靶向VEGFA的候选小分子化合物。运用不同浓度候选小分子化合物分别干预人GC细胞AGS、HGC27,采用CCK8方法分别测定人GC细胞在12 h,24 h,36 h、48 h及60 h的生长状况,以明确它们对AGS、HGC的抑制作用。对筛选出的5个候选小分子化合物与VEGFA复合体系之间的结合自由能采用分子动力学模拟（Molecular Dynamics Simulation,MD）与MM-GBSA方法进行测算与比对,并分别建立了其中3种进行生物活性实验的小分子候选化合物与VEGFA靶标蛋白结合自由能残基分解图、结合自由能肼图、氢键占有率图及其在VEGFA活性位点的构象空间图形。（2）采用网络药理分析PGG治疗GC潜在的药理机制。首先,在HIT、SEA和Super PRED数据库中搜索PGG的目标。对PGG治疗GC的关键靶点在Gene Cards和DisGeNET数据库中进行了预估。通过Venn图获得PGG和GC的交叉靶点,然后进行蛋白质-蛋白质相互作用分析以筛选中枢靶点,并对其的功能与富集通路在基因表达数据库（Gene Expression Omnibus,GEO或GO）与京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）中进行分析处理。最后,在癌症基因组图谱数据库对PGG治疗GC的中枢靶点进行差异性表达和生存分析。（3）采用CCK8法检测不同浓度PGG在不同时间段（0 h、12 h、24 h、36h、48 h、60 h）分别处理人GC细胞AGS、HGC27的增殖抑制率;随后,我们选取PGG的最佳浓度与最佳作用时间处理人GC细胞进行后续实验。采用集落形成实验、流式细胞仪检测、Transwell测定与划痕愈合实验以进一步明确PGG影响GC细胞克隆形成、细胞周期及凋亡、细胞侵袭能力与细胞迁移等情况。利用流式细胞仪分析、MDC染色、DAPI、PCR、WB等方法依次测定PGG诱导GC细胞的凋亡与自噬过度激活情况,并测定相关通路的基因与蛋白表达。（4）最后,构建GC裸鼠体内成瘤模型,在PGG的不同干预时间测量瘤重、肿瘤体积及裸鼠体重,并利用免疫组化技术,苏木精一伊红染色,TUNEL检测等方法测定PGG对裸鼠体内肿瘤的作用效果。结果:（1）CADD技术结合TCMSP依据打分函数排序筛选出5种靶向VEGFA的小分子化合物,结果表明PGG评分最高。对筛选出的其中3种小分子候选化合物分别进行CCK8活力测定,结果表明PGG抑制人GC细胞生长的作用最强。MD结果表明,PGG-VEGFA复合体系最稳定。（2）网络药理学分析结合分子对接法预测PGG治疗GC的3个中枢靶点,分别为MAPK14、BCL2L1和VEGFA。富集分析表明,这些中枢靶点富含MAPK、神经营养素、PD-L1检查点、PI3K-Akt、RAS和HIF-1信号通路。（3）CCK8活性实验结果表明,PGG可显著抑制人GC细胞活性,且与浓度、时间相关。选取IC50 PGG处理人GC细胞48 h,CCK8测定可见,PGG显著抑制人GC细胞存活;集落形成实验可见,PGG显著减少GC细胞克隆的数量。划痕愈合实验显示PGG可明显阻止GC细胞迁移。Transwell测定提示PGG可有效阻滞GC细胞的侵袭能力。流式细胞分析可见PGG显著增加GC细胞凋亡数量;采用IC50 PGG处理AGS、HGC27细胞0 h、24 h、48 h,流式细胞仪显示PGG诱导GC细胞凋亡的最佳时间为48 h,且PGG使细胞生长停滞在G1/S期。Western blot检测结果显示IC50 PGG处理AGS、HGC27细胞48 h时显著下调p-ERK及p-JNK的蛋白表达,但ERK和JNK总蛋白的表达水平未见明显统计学差异性。结果说明,PGG诱导GC的凋亡可能与ERK/JNK信号通路相关。IC50 PGG与Rapamycin（1μM）分别处理的HGC27、AGS细胞0 h、24 h、48 h,MDC染色可见大量酸性自噬空泡,同时DAPI染色可见凋亡小体形成,尤以48h时为著。WB检测可见,LC3表达上调,LC3-II/LC3-I比率增加。结果表明PGG可激活GC细胞自噬,且与诱导GC细胞凋亡最佳时间相符。用IC50 PGG分别处理HGC27、AGS细胞48 h;使用3-MA（4μM）,Z-VAD-FMK（10μM）处理细胞48 h;同时采用3-MA（4μM）及Z-VAD-FMK（10μM）联合IC50 PGG处理细胞48h。结果表明,PGG处理GC细胞中凋亡与自噬之间存在潜在相互作用。q-PCR测定可见IC50 PGG处理AGS与HGC27细胞48 h时VEGFA mRNA的表达显著下降;同时WB分析显示VEGFA蛋白表达明显下降。结果表明,VEGFA可能是细胞凋亡和自噬之间存在潜在串扰关系的重要靶点。（4）在12只4-6周龄的裸鼠体内构建GC体内模型。与对照组相比,从第14天开始,PGG治疗显示出明显的抑癌作用。此外,在实验期间,PGG治疗组肿瘤体积以及瘤重均有所下降,但小鼠体重增加,表明PGG可有效遏制GC细胞生长,且安全性较高。制备肿瘤组织切片,采用免疫组化染色检测ki67的表达,与对照组相比,PGG处理可使Ki67阳性表达减少。TUNEL染色可见相较于对照组,PGG治疗组中的荧光数量变强,代表GC细胞的凋亡数量明显增加。结果表明,PGG对裸鼠体内GC细胞的凋亡具有明显的促进作用。结论:（1）CADD技术中基于分子对接的结构虚拟筛选为合理设计有效靶向VEGFA新型小分子抑制剂PGG提供了化学信息学的理论性指导性。（2）网络药理学结合分子对接法预测了PGG对GC潜在抗癌中枢靶点和信号通路。为揭示PGG抗GC的作用机制奠定了重要的生物信息学基础。（3）PGG在不同人GC细胞系中通过靶向VEGFA经由ERK/JNK途径介导可能会导致GC细胞发生两种不同类型的细胞死亡即凋亡和自噬。因此,PGG可能通过多种肿瘤细胞内调节机制,在癌症预防和治疗中发挥潜在作用,未来可作为一种天然来源的新型植物抗癌剂。