[研究背景与目的]辨证论治是中医认识和治疗疾病的基本原则,而寒热则是辨别疾病性质的纲领。其中,中药寒、热、温、凉药性是中医辨证论治、谴方用药的重要依据之一。课题组前期在对临床常用抗肿瘤方中药进行统计分析,发现大部分抗肿瘤中药都具有十分鲜明的寒热属性。但许多寒热中药在中医临床治疗肿瘤时对肿瘤及转移是促进还是抑制存在诸多争议,使得临床医生在治疗肿瘤时困惑。国内外大量研究也表明,寒热属性成分对不同肿瘤转移的进程大多存在相反的结果。是否由于寒/热属性成分作用于肿瘤细胞上相应的感知受体,从而导致对肿瘤细胞的生物学行为有不同的影响呢?哺乳动物的感觉系统之所以能够感受到外界温度变化及各种寒热化合物的刺激,Thermo-TRPs(温度敏感型瞬时受体电位通道蛋白,Thermo-Transient Receptor Potential Channel,thermo-TRP)起到重要的作用。Thermo-TRPs 包含热敏受体 TRPV1-4、TRPM2-5,冷敏受体TRPM8、TRPC5及TRPA1等共1 1个成员。Thermo-TRPs能够感知并响应温度变化,而寒热属性成分能够影响机体的寒热感知,且众多寒热属性成分均被报道对Thermo-TRPs 具有一定的调控作用,提示我们 TRP 或许是寒热属性成分的共同作用靶点?课题组对不同癌症中的Thermo-TRP的表达水平进行分析,发现冷热敏受体在不同肿瘤间存在聚类现象:在乳腺癌、皮肤癌等肿瘤中,热敏受体表达显著增加;而在结肠癌、肝癌和胃癌等肿瘤中,冷敏受体呈现高表达。基于分析结果,课题组对多种癌症的Thermo-TRP蛋白表达水平进行检测进行了初探,发现胃癌中冷敏受体TRPC5显著高表达。恶性胃癌增殖快、浸润性强,而转移则是造成胃癌患者死亡的重要原因。前期分析和实验初步探索显示TRPC5在胃癌中显著高表达,那么是否能够将TRPC5作为胃癌的治疗靶标,并从抗肿瘤中药中筛选出有效化合物来抑制胃癌转移的进程?因此,我们通过生物信息学分析结合一系列体内外实验手段验证了 Kaempferol对TRPC5的调控作用,以及对胃癌转移抑制作用的分子机制和生物学基础。[研究方法与结果](1)本课题第一部分实验研究通过生物信息学分析以及对临床胃癌样本的分析,发现TRPC5在胃癌患者中高表达,其表达水平与患者的生存期呈负相关。进一步在细胞水平上的研究显示TRPC5在多种胃癌细胞中的表达水平高于胃正常上皮细胞,其表达水平与之介导的钙内流呈正相关。(2)本课题第二部分实验研究综合Transwell、倒置侵袭和划痕等多项体外实验及体内转移实验验证了 TRPC5的高表达能够促进胃癌的转移,抑制其功能及表达可抑制胃癌转移。(3)本课题第三部分实验研究首先通过钙成像和药物蛋白结合实验验证了 Kaempferol可以通过与TRPC5结合抑制TRPC5的开放及其介导的钙内流。进一步通过Transwell、倒置侵袭和划痕等多项体外实验及体内转移实验验证了 Kaempferol在体内、外对均能显著抑制胃癌的转移。(4)本课题第四部分实验研究首先结合数据库分析和活细胞成像实验发现TRPC5的功能与细胞运动性密切相关。在此基础上,进一步通过数据库分析和文献调研发现,TRPC5对胃癌细胞运动性的调控可能与丝状伪足的形成密切相关,而实验结果也表明TRPC5通过调控胃癌细胞丝状伪足的形成来调控其运动性,进而影响胃癌转移进程。(5)本课题最后一部分实验研究主要是通过多种分子生物学手段和生物信息学分析对TRPC5的机制进行深入挖掘和探究。实验结果则显示TRPC5通道的激活能够促进细胞内Ca2+-CaM复合物形成,进而促进MLC的活化。MLC的活化能够促进cortactin的活化,使其定位于丝状伪足尖端,从而增强丝状伪足的稳定性。总的来说,TRPC5通过p-MLC/ATP/p-cortactin信号轴调控丝状伪足的形成,从而影响胃癌细胞的运动性及其转移进程。[结论与意义]该项研究结合生物信息学分析、临床样本及体内外多项实验,从多个角度确证了TRPC5的表达与胃癌发生发展呈负相关,提示TRPC5或许可以作为胃癌治疗的一个潜在靶点。进一步进行机制探讨,发现TRPC5能够通过p-MLC/ATP/p-cortactin信号轴调控胃癌丝状伪足的形成,揭示丝状伪足在促进胃癌转移中的具体作用机制,为胃癌转移提供新的治疗策略。发掘存在于多种传统抗肿瘤中药中的有效成分kaempferol,并验证其抗胃癌转移的效应及机制,为临床抗胃癌转移药物的开发提供依据。同时,基于Thermo-TRPs揭示“寒者热之,热者寒之”在肿瘤治疗中的规律,从而增强临床用药精准性,为开展其他治则治法的研究提供可借鉴的思路和方法。