论文部分内容阅读
目的泛素-蛋白酶体通路(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)是生物体内蛋白质选择性降解的重要途径,可影响基因表达调控、细胞周期、氧化应激反应等多种细胞活动。蛋白酶体活性的异常改变,可引起多种蛋白质降解异常,导致细胞功能紊乱,使肿瘤细胞持续生长,是肿瘤发生的标志之一。蛋白酶体抑制剂特异性地抑制蛋白酶体活性,阻止肿瘤生长、粘附及血管生成，可以作为抗肿瘤治疗的有效靶点。硼替佐米(Bortezomib,商品名万坷,Velcade)是高选择性的,可逆性的蛋白酶体抑制剂,通过抑制多种蛋白质的降解,可以稳定p21,p27和p53蛋白,转录因子(如c-myc、c-fos、c-jun), IκB,细胞周期调节蛋白和一些Bcl-2家族成员(如Bak and Bax)。在生理情况下NF-κB在胞质中与抑制蛋白IκB结合,硼替佐米通过抑制IκB的降解,下调NF-κB的活性,不但可以增加肿瘤细胞的凋亡,还可以增加肿瘤细胞对化疗、放疗、免疫治疗的敏感性。X连锁凋亡抑制蛋白(X chromosome linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)是内源性凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis, IAPs)中效力最强的蛋白,它主要通过BIR3结构域抑制caspase-9, BIR2结构域抑制caspase-3和-7,达到抑制凋亡的作用。XIAP的表达受多条信号转导通路的影响,NF-κB, PI3K和MAPK等均可间接调节XIAP的转录。有资料显示XIAP基因在多个白血病细胞株及急性白血病原代细胞中高表达,这提示XIAP可能与白血病的发生、病程演变及预后等密切相关。本研究观察硼替佐米对K562细胞增殖、凋亡及XIAP基因和蛋白表达的影响,研究硼替佐米对白血病细胞的作用及其与XIAP之间的关系,为其做为新的抗白血病药物提供实验依据。方法1.水溶性四唑盐光吸收(WST-1)法检测细胞增殖：终浓度为5nmol/L, 10nmol/L,30nmol/L,50nmol/L,100nmol/L硼替佐米分别作用于K562细胞12h、24h、36h、48h, WST-1法检测细胞的增殖情况,计算增殖抑制率,并找出硼替佐米作用于K562细胞的最适时间及作用浓度。2.瑞氏染色观察细胞形态：终浓度为30nmol/L硼替佐米处理K562细胞24h后,瑞氏染色观察细胞生长状态及形态学变化。3.流式细胞术检测细胞凋亡：终浓度为5nmol/L, 10mol/L,30nmol/L, 50nmol/L, 100nmol/L硼替佐米分别作用于K562细胞24h,流式细胞仪AnnexinⅤFITC/PI双标检测细胞凋亡率。4.原位末端转移酶标记(TUNEL)技术检测细胞凋亡：终浓度为30nmol/L硼替佐米处理K562细胞24h后,TUNEL技术检测细胞的凋亡情况。5. RT-PCR法检测XIAP mRNA的表达：终浓度为5nmol/L,10nmol/L 30nmol/L,50nmol/L,100nmol/L硼替佐米分别作用于K562细胞24h,RT-PCR法检测硼替佐米对K562细胞XIAP mRNA表达的影响。6.免疫组化法检测XIAP蛋白的表达：终浓度为30nmol/L硼替佐米作用于K562细胞24h,免疫组化法检测硼替佐米对K562细胞XIAP蛋白表达的影响。7.统计分析：所得结果应用SPSS13.0统计学软件处理,对计量资料,同一时间点各实验组与对照组之间比较用两样本t检验,计数资料采用χ2检验,统计学数据用均数±标准差(x±s)表示。以α=0.05为检验水准,P<0.05为差异有显著性。结果1.WST-1结果显示：终浓度为5nmol/L、10nmol/L、30nmol/L、50nmol/L、100nmol/L的硼替佐米分别作于K562细胞24小时,细胞增殖抑制率分别为(13.6±0.15)%、(28.7±0.49)%、(55.4±1.11)%、(68.1±1.12)%、(81.4±0.13)%,分别与空白对照组比较存在显著差异(P<0.01)；硼替佐米组间两两比较,具有显著性差异(P<0.05),其24小时IC50为24.6 nmol/L。30nmol/L硼替佐米分别作用于K562细胞12小时、24小时、36小时、48小时,细胞增殖抑制率为(29.1±0.92)%、(55.4±1.11)%、(57.8±0.84)%、(59.8±1.18)%,分别与空白对照组相比,有显著性差异(P<0.05)；组间两两比较,硼替佐米12h与24h对K562细胞的抑制率有显著性差异(P>0.05),但24h与36h、48h的抑制率无显著性差异(P>0.05)。2.细胞形态、TUNEL及流式细胞术结果显示：终浓度为30nmol/L硼替佐米处理K562细胞24h,瑞氏染色,光学显微镜下示硼替佐米组细胞呈现凋亡形态学改变,表现为染色质浓缩,核固缩、核边集、核碎裂,胞质中见大量空泡及凋亡小体形成；正常对照组细胞形态正常。TUNEL法计数300个细胞中阳性细胞数为147,阳性率为49.0%,与空白对照组(阳性细胞数7,阳性率2.3%)比较差异有统计学意义(P<0.01)。浓度为5nmol/L、10nmol/L、30nmol/L、50nmol/L、100nmol/L的硼替佐米分别作于K562细胞24小时,AnnexinV FITC/PI双标结果显示凋亡率分别为：(15.36±0.7)%,(32.21±1.2)%,(53.87±1.3)%,(77.85±1.0)%,(81.25±2.8)%。均高于对照组(0.32±0.6%),P<0.01。进一步行组间两两比较,有显著统计学差异(P<0.05)。3. RT-PCR和免疫组化结果显示：浓度为5nmol/L、10nmol/L、30nmol/L、50nmol/L、100nmol/L的硼替佐米分别作于K562细胞24小时后,RT-PCR扩增结果显示,XIAP mRNA灰度比值分别为0.89±0.029,0.79±0.022,0.59±0.031,0.34±0.037,0.24±0.042,与空白对照组(0.96±0.020)相比有显著差异,p<0.01；不同浓度硼替佐米之间XIAP mRNA灰度比值相比有显著差异,p<0.05。终浓度为30nmol/L硼替佐米处理细胞24h后,经免疫组化法染色法检测结果显示：K562细胞中XIAP蛋白阳性表达率在硼替佐米组为(13.33±2.71)%,与空白组(55.90±1.65)%相比显著降低(P<0.01)。硼替佐米组XIAP蛋白表达阳性平均积分为42.00±8.54,较空白组248.33±20.74有显著性差异(P<0.01)。结论1.硼替佐米能有效抑制K562细胞的增殖,其抑制作用具有时间和浓度依赖性。2.硼替佐米能明显诱导K562细胞凋亡,随时间增加凋亡率增加。3.硼替佐米能明显下调K562细胞XIAP mRNA及XIAP蛋白的表达,从而增加细胞凋亡。4.蛋白酶体抑制剂可以有效诱导白血病K562细胞凋亡,这种效应可能通过硼替佐米下调NF-κB活性,降低XIAP基因的转录,从而使caspase活性增高来发挥,以此为白血病的治疗提供了新的策略及新的治疗思路。