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背景与目的心力衰竭患者接受心脏手术时可能经历心肌缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI),给麻醉及患者生命安全造成严重威胁。经典的缺血预处理(ischemic preconditioning,IPC)对高血糖、高血脂、高血压、心力衰竭等有病理性改变的心脏可能失去保护作用。因此,探讨阿片预处理对心力衰竭心脏的保护作用及其信号机制具有重要意义。本课题组前期研究证明吗啡预处理(morphine preconditioning,MPC)可减轻心力衰竭大鼠在体和离体心脏IRI,但其分子信号机制仍不明确。p38信号通路属于丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)家族,该信号通路活化在心肌IRI中发挥何种作用,目前还存在争议。因此,本研究探讨p38 MAPK信号通路在吗啡预处理减轻心力衰竭大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用以及机制。方法(1)雄性成年SD大鼠,体重为200~240 g,采用尾静脉注射多柔比星2 mg/kg,每周一次,连续注射6周,总量为12 mg/kg,制备大鼠慢性心力衰竭的模型。第8周末时,取已成功制备慢性心力衰竭模型的SD大鼠50只,采用随机数字表法,将其分为5组(n=10):假手术组(Sham)、缺血再灌注组(IR)、吗啡预处理组(MPC)、p38MAPK抑制剂SB203580(SB)+MPC组(MSB)、SB203580对照组(SB)。采用Langendorff离体心脏灌注以及结扎左冠状动脉前降支(LAD)法制备大鼠心肌缺血再灌注损伤模型。除Sham组只缝线,不结扎LAD外,其余各组均进行LAD结扎,缺血30 min、再灌注120 min。MPC组在结扎LAD前,先灌注含1mmol/L吗啡的Krebs-Henseleit buffer(K-H)液进行预处理,灌注5 min,再次灌注无吗啡K-H液5min,共3个循环。MSB组于吗啡预处理前10 min,用含SB203580(5mmol/L)的K-H液进行灌注,持续灌注至缺血5 min,共计45 min。SB组仅于缺血前40 min开始,持续灌注含SB203580(5mmol/L)的K-H液,直至缺血5 min,但不进行MPC。以上各组分别于基线、再灌注5min、10min时采集冠状动脉流出液,利用微板法检测冠脉流出液中乳酸脱氢酶(ldh)活性;于再灌注结束时,氯化三苯基四氮唑(ttc)染色检测心肌缺血危险区体积(aar)、梗死区体积(is)及is/aar比值;于再灌注10min时取心室肌组织,westernblot法检测p-p38以及p38的相对表达。(2)在细胞水平,提取并培养sd大鼠乳鼠原代心肌细胞,多柔比星处理24小时后,随机分为5组(n=4):对照组(con)、缺氧复氧组(hr)、吗啡预处理组(mpc)、p38mapk抑制剂sb203580(sb)+mpc组(msb)、sb203580对照组(sb)。con组细胞正常培养,其余各组细胞先利用缺氧小室,用5%co2+95%n2的混合气造成缺氧的环境,培养4h,随后继续在正常氧浓度下培养2h,建立原代心肌细胞缺氧再给氧损伤的模型。mpc组细胞于缺氧前用含1mmol/l吗啡的培养液孵育10min,msb组于吗啡预处理前10min加入sb203580(5mmol/l)。sb组于缺氧前20min加入sb203580(5mmol/l),但不进行mpc。处理结束后,采用cellcountingkit-8(cck-8)法检测细胞增殖;微板法检测细胞培养液中ldh活性;annexin-v-fitc/pi双染法检测细胞凋亡;westernblot检测p-p38/p38,p-glycogensynthasekinase-3b/glycogensynthasekinase-3b(p-gsk-3β/gsk-3β),p-connexin43/connexin43(p-cx43/cx43)蛋白的表达;实时定量pcr(qrt-pcr)检测bcelllymphoma-2(bcl-2)、bcl-2associatedx(bax)表达水平。结果(1)在离体心脏实验中,与sham组比较,ir组再灌注时ldh活性升高,is和is/aar增加(p<0.05);mpc降低再灌注时ldh活性,减小is和is/aar,并诱导p38磷酸化水平升高(p<0.05);相反,sb203580可抑制p38磷酸化,并阻断mpc的心肌保护作用。(2)在心肌细胞水平,与con组比较,hr组细胞活力降低,细胞培养液中ldh活性升高,心肌细胞凋亡比例增加(p<0.05);mpc可显著提高细胞活力,降低细胞培养液中ldh活性,抑制心肌细胞凋亡(p<0.05),但sb203580可阻断mpc的心肌细胞保护作用。此外,mpc可诱导心肌细胞内p38磷酸化,并增加下游p-gsk-3β和p-cx43表达水平,升高bcl-2/bax比值(p<0.05);以上作用均可被sb203580所阻断。结论 吗啡预处理可能通过激活p38 MAPK信号通路,调控下游GSK-3β和Cx43信号蛋白以及凋亡相关基因Bcl-2/Bax的表达,从而减轻心力衰竭大鼠心肌的缺血再灌注损伤。