花生维生素E合成关键酶基因(VTE3、HPT)的克隆、序列分析与γ-tmt基因的转化研究

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维生素E是一种脂溶性抗氧化剂,对动、植物和人体都有非常重要的生理作用。然而天然维生素E只能由光合细菌和绿色植物合成,人体必须从外界摄取。植物油是人体摄取维生素E的主要途径。花生作为重要的油料作物,是人体所需维生素E的重要来源之一。本研究基于花生EST序列,结合RT-PCR技术以及以基因组DNA为模板的PCR扩增方法,首次从花生中克隆了维生素E合成途径的关键酶基因2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶基因(VTE3)和尿黑酸植基转移酶基因(HPT),并且分别克隆了13个不同类型花生栽培品种和6个二倍体野生种的VTE3 DNA序列,在比较各序列同源性的基础上,对不同类型花生栽培品种是否有相同起源问题以及花生栽培种与各野生种之间的亲缘关系进行了分析探讨;利用农杆菌介导法将拟南芥γ-维生素E甲基转移酶基因(γ-tmt)转入花生栽培品种得到T0代和T1代阳性转化植株。取得的主要研究结果如下:(1)从丰花2号、兰娜1号和荔浦大花生3个栽培品种中分别克隆到2条VTE3 cDNA片段,命名为rVTE3-1和rVTE3-2。品种间相应序列同源性为100%。rVTE3-1和rVTE3-2的编码区长1059 bp,均编码351个氨基酸,二者核苷酸序列同源性97.8%,存在10个变异位点,其中8个为SNP变异;氨基酸序列同源性98.6%,存在5个氨基酸差异。(2)从花生栽培品种Krapt.st.16中克隆得到一条HPT cDNA片段,长1269 bp,命名为AhHPT。AhHPT最大开放阅读框为1230 bp,编码含有409个氨基酸残基,与大豆、苜蓿、木薯、拟南芥等16种植物的HPT蛋白序列同源性较高,为61.46% 79.71%。(3)从13个栽培品种分别克隆得到2条VTE3 DNA片段,命名为gVTE3-1和gVTE3-2。gVTE3-1在13个品种间核苷酸序列同源性为99.9%, gVTE3-2核苷酸序列同源性为100%。丰花2号gVTE3-1和gVTE3-2同源性96.6%,内含子存在36个SNP位点和3个限制性内切酶识别的多态性位点。从6个二倍体野生花生分别克隆得到一条VTE3 DNA片段,A染色体组4个野生种以及B染色体组野生种A. batizocoi的gVTE3同源性达99.9%以上,仅有2个碱基的差异。B染色体组野生种A. ipaensis的gVTE3与其余野生种gVTE3同源性相对较低,为97.0%。A. ipaensis的gVTE3与丰花2号gVTE3-2同源性100%;丰花2号gVTE3-1与A染色体组野生种的gVTE3同源性相对较高,最高为98.7%。进化树分析显示,丰花2号的gVTE3-2与A. ipaensis的gVTE3聚为一组;A染色体组4个野生种和B染色体组野生种A. batizocoi的gVTE3以及丰花2号gVTE3-1聚为一组。(4)得到164株具有PPT抗性并且PCR检测目的基因(γ-tmt)呈阳性的转基因植株,经扩繁后移栽成活T0代单株560个,获得其T1代种子;获得来自34个株系T1代单株356个,经PCR检测其中185个植株呈阳性,获得其T2代种子。
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