研究目的:在临床上颅内肿瘤侵蚀、颅脑手术、严重的创伤等因素造成的硬脑膜缺损是比较常见的,此时需要修补硬膜来预防脑脊液漏、颅内感染、组织粘连以及保护颅内脑组织。各国学者在一百多年中不断探索硬脑膜修补的方法与材料,据文献报道的硬脑膜修补材料已达数十种,大致分成了自体材料、同种异体材料、异种生物来源材料和人工合成材料等四大类。自体组织修补材料具有不发生免疫排斥反应、避免因移植感染相关病原体的可能,以及良好的经济性等优点,但缺点是取材尺寸及形状有限制,且需额外进行手术增加患者的创伤及痛苦。同种异体材料因来源有限未能广泛应用于临床。异种生物来源材料广泛应用于临床,但仿生性尚待进一步提高。人工合成高分子类材料具有价格相对便宜、无潜在的病原体感染风险等优点,但组织相容性及生物活性方面仍有不足。随着修补材料领域的发展,越来越多的细胞外基质材料因兼顾生物相容性并且最大程度保留了细胞外基质（ECM,extracellular matrix）空间三维结构以及生物活性,成为组织工程领域的研究热点并越来越多的应用于临床。本研究采用猪硬脑膜为原材料,通过联合多种脱细胞方法、冻干等流程制备不同构型的脱细胞的细胞外基质（d ECM,decellularized extracellular matrix）,探索制备具有原位仿生结构的新型硬脑膜修补材料。1.探索适用于猪硬脑膜组织的脱细胞方案,评估脱细胞效果、组织学形态、组织主要成分含量及机械性能;2.评价两种不同构型的新型材料的生物相容性及安全性;3.通过修复兔硬脑膜缺损评价新型材料的硬膜修复功效及体内反应。研究方法:1、探索联合应用物理法（低渗液溶胀细胞膜）、化学法（Triton X-100、SDS）、生物法（DNA酶和RNA酶）等脱细胞方法确定合适的猪硬脑膜脱细胞方案,既保证脱细胞彻底且最大程度保留细胞外基质基本结构。对猪硬脑膜细胞外基质分别进行低温阴干和冻干制备新型脱细胞修补材料（DM,decellularized dura mater）和脱细胞冻干修补材料（L-DM,lyophilized-decellularized dura mater）。组织学检测评估组织中细胞的残留情况以及基本的组织结构,并对新型材料中残留的DNA、α-Gal抗原表位、胶原蛋白、糖胺聚糖等含量进行检测。对两种新型材料的机械力学性能、表面超微结构特性（扫描电子显微镜、原子力显微镜）等进行评价。2、对两种新型材料进行体内外生物相容性分析。针对两种新型修补材料进行SDS残留量检测,制备浸提液行细胞毒性实验,使用L929细胞与两种新型材料共培养评估细胞在材料表面定植及迁移情况。使用活体家兔进行皮下致敏试验、使用SD大鼠进行皮下植入试验,评估新型材料致敏性及排斥反应。3、脱细胞硬脑膜修补缺损硬膜的体内研究。制备家兔硬脑膜缺损模型,分别使用实验动物自体颅骨骨膜（PM,pericranium）、DM和L-DM修补硬脑膜缺损。分别在术后2个月和12个月两个时间点对三组动物进行取材。取材前行活体头部磁共振检查评价实验动物硬脑膜恢复情况及脑组织并发症。取材前抽取血液进行血液学检测评估实验动物血液成分变化及对肝肾功能的影响。对硬脑膜修补区域及肝、肾、脾等重要脏器行组织学检测评估修补效果及材料长期植入对重要脏器的影响。研究结果:1、两组新型材料HE染色和DAPI染色均未见肉眼可见的细胞核成分,Masson染色可见脱细胞处理后组织较完整的保留了细胞外基质中的胶原纤维结构。新鲜猪硬脑膜DNA含量为240.61±19.04ng/mg,经脱细胞等流程制备的新型材料DM组DNA含量为29.88±3.27ng/mg,L-DM组DNA含量为30.11±5.73 ng/mg。DNA琼脂糖凝胶电泳验证了DM和L-DM均未见明显DNA条带,达到国际通行的脱细胞标准。新鲜猪硬脑膜组的α-Gal抗原表位含量为13.363±1.697 ng/mg,而经过脱细胞处理后组织中残留的α-Gal抗原表位含量仅为3.388±0.421 ng/mg,两者之间具有显著的统计学差异（P＜0.05）,α-Gal消除率为74.60%。未脱细胞的猪硬脑膜胶原蛋白含量为571.94±92.11μg/mg,脱细胞处理后材料中胶原蛋白的含量为818.04±153.16μg/mg,提示脱细胞效果良好ECM主要成分胶原仍保持较高的水平。猪硬脑膜脱细胞前糖胺聚糖含量为3.108±0.104μg/mg,经脱细胞处理后糖胺聚糖的含量为2.399±0.296μg/mg,两者具有统计学差异（P＜0.05）,但糖胺聚糖多数仍得以保留。机械力学实验中,DM组和L-DM组断裂应力分别为3.368±0.413 MPa和1.307±0.247 MPa,断裂应变分别为18.24±3.82%和12.24±3.59%,两者之间具有统计学差异（P＜0.05）。通过扫描电子显微镜（SEM）观察到两组新型材料三维空间结构与人硬脑膜高度相似,原子力显微镜检测DM组和L-DM组表面粗糙度Sq分别为42.50±11.55 nm和57.80±17.86 nm。2、两种新型材料（DM和L-DM）残留SDS为0.00053±0.00029%和0.00048±0.00007%,均小于浓度安全剂量50 mg/L（即浓度0.005%）的标准。CCK-8法细胞毒性检测验证两组材料均无明显细胞毒性并且对细胞增殖略有促进作用。SEM观察到成纤维细胞在两种新型材料表面定植与迁移良好。在背部皮下植入的大鼠模型中,两组新型材料均未引发强烈的免疫排斥反应,术后14天可观察到L-DM组较DM组更早的开始ECM重建,材料降解速度与ECM重建速度相匹配。3、通过建立兔硬脑膜缺损模型,比较自体颅骨骨膜、DM和L-DM修补效果。比较头部磁共振检查未见术区脓肿、脑积水、皮质损伤后液化等并发症。头部磁共振检查见术区皮质结构完整,三组在T2像和矢状位像均可见贴近术区皮层上方的线形高信号影,从影像学角度验证硬脑膜重建良好。三组动物术后切口局部未见发炎、皮下脓肿形成、脑脊液漏等异常表现,均无抽搐发作、肢体瘫痪、步态异常等行为改变。组织学检测观察到DM和L-DM在术后2个月未被完全降解,新生ECM组织在DM和L-DM内沿材料纤维束的重建具有方向性;术后12个月硬脑膜ECM重建已接近完成,但DM和L-DM仍可见少量残存维系修补区域的稳定性。DM和L-DM对肝肾脾等重要脏器及血液系统均未见明显影响。研究结论:1、应用本研究制定的脱细胞方案制备的两种不同构型的新型材料达到生物材料脱细胞标准,材料的空间三维结构与人类硬脑膜相似。2、两种新型材料均具有良好的生物相容性,兔硬脑膜缺损修复实验证实具有良好的修复效果,并且长期植入安全可靠,对重要脏器及血液系统无明显影响。