第一部分 急性髓系白血病免疫治疗的常见靶点抗原分析目的急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是一种高度异质性的肿瘤,很难选择一个普适性的免疫治疗靶点。只有通过对伴不同特征的AML亚群的靶点抗原进行深入分析,才有可能发现适合的靶点,实现安全高效的个性化免疫治疗。因此,本研究第一部分究旨在分析伴不同基因突变、原发或继发、初诊或复发/难治（Relapsed or refractory,R/R）AML常见及潜在靶点抗原的表达情况,以期找到伴不同特征AML亚群更为合适的免疫治疗靶点以及潜在的新靶点。方法纳入2013年1月-2021年12月在华中科技大学附属同济医院初诊为AML（非急性早幼粒细胞白血病）的患者,收集这些患者的临床及实验室资料。按照危险分层、基因突变情况、原发或继发、初诊或R/RAML分别进行分组,比较组间靶点抗原的表达差异。结果本部分研究共纳入1024例AML患者。流式细胞免疫分型分析发现,在各靶点抗原中,干/祖细胞抗原CD117的阳性率最高,为97.2%;其次是髓系抗原CD33,其阳性率为93.7%;而淋系抗原的表达相对较低,其中表达最高的为CD9,阳性率为49.5%。预后良好组患者CD38、CD96的阳性率明显高于预后不良组,而CD4、CD9的阳性率却明显低于预后不良组（P＜0.05）。CD117、CD123、CD33的表达在三组间无明显差异（P＞0.05）。与伴FLT3wt/NPM1wt的AML患者相比,伴FLT3wt/NPM1mut的患者CD123的阳性率显著升高,伴FLT3-ITDmut/NPM1wt患者CD123、CD4和CD9的阳性率明显升高,伴FLT3-ITDmut/NPM1mut患者CD123、CD9的阳性率也明显升高（P＜0.05）。CD38、CD7、CD96在伴CEBPA双突变患者中的表达均明显高于无此突变的患者（P＜0.05）。而在伴DNMT3A突变和野生型患者中,这些靶点抗原的表达均没有显著差异（P＞0.05）。在伴IDH突变的患者中,CD4、CD7、CD96的阳性率均显著低于无IDH突变的患者（P＜0.05）。与原发AML相比,继发性AML患者CD38的阳性率更低（P=0.005）,两组间其他抗原表达均无显著差异。R/RAML的CD38、CD123、CD4、CD7、CD9的阳性率均显著高于初诊患者（P＜0.05）。患者R/R前后的配对检验显示,CD38、CD123、CD9在患者R/R时均出现高频率的获得,使其在R/R时的表达均高于初诊时（P＜0.05）。同时,R/R AML在初诊时的CD4和CD9阳性率明显高于同期非R/R的患者（P＜0.05）。多因素Logistic回归分析表明,CD9阳性是AML患者出现R/R的独立危险因素（P=0.010）。在预后方面,CD123阳性患者的总生存期（Overall survival,OS）显著低于CD123阴性的患者（中位OS 65.4个月vs未达到,P=0.011）。CD9阳性和阴性患者的OS也有同样趋势（中位OS 38.8个月vs未达到,P=0.012）。其他靶点抗原对AML的OS无明显影响（P＞0.05）。结论AML患者靶点抗原的表达存在明显的异质性。CD9与AML患者FLT3-ITD突变、R/R和预后不良相关,可能是一个新的AML免疫治疗靶点。此外,FLT3-ITD突变的患者CD123、CD9高表达,或许更能从以CD123、CD9为靶点的免疫治疗中获益;除CD38更适合作为原发AML的靶点外,其他靶点对于原发、继发AML具有相似的适用性;CD38、CD9、CD123在R/R AML患者高表达,可作为R/R AML患者更为合适的免疫治疗靶点。第二部分 地西他滨对AML细胞免疫治疗靶点的影响目的本研究的第一部分发现各靶点抗原在不同AML亚群的表达有明显的异质性,而靶点抗原的表达密度严重影响AML免疫治疗的效果。那么,如何提高靶点抗原的表达从而增强免疫治疗的效果显得尤为重要。因此,本研究的第二部分旨在分析去甲基化药物地西他滨对AML细胞常见和潜在免疫治疗靶点表达的影响以及相关的分子机制。方法收集2013年1月-2020年12月在华中科技大学附属同济医院初诊为AML（非急性早幼粒细胞白血病）并在第1疗程接受含地西他滨方案治疗的患者的资料,比较治疗前后常见靶点抗原的变化。使用流式细胞术在THP-1、SKM-1、KG-1、OCI-AML3、MV4-11、Kasumi-6、Molm13、HL-60 和 U937 这 9 种 AML 细胞系中验证地西他滨处理后AML细胞表面靶点抗原表达的变化。对地西他滨处理后的SKM-1、Molm-13和U937这3种AML细胞系进行RNA-seq,比较15个常见及6个潜在免疫治疗靶点在地西他滨处理组与对照组中的表达差异。对3种细胞系的差异表达基因（Differentially expressed gene,DEGs）进行 GO、KEGG、GSEA 富集分析,探索可能涉及的信号通路。结果本部分研究共纳入95例接受含地西他滨方案治疗的AML患者。比较治疗前后AML患者靶点抗原表达的变化,发现CD38、CD123和CD9的阳性率在地西他滨治疗后均显著上调（P＜0.05）。配对分析显示,分别有18.4%、48.3%和60.0%的AML患者在地西他滨治疗后CD38、CD123和CD9表达从阴性转成阳性。使用流式细胞术在9种AML细胞系中检测CD9、CD38、CD123的表达,发现3种靶点抗原在上述AML细胞系中的表达阳性率差异大（1%～100%）,表达强度明显不一。与对照组相比,CD9、CD38在地西他滨处理后的上述9种AML细胞系中均显著上调,CD123在地西他滨处理后的除Molm13和MV4-11外的7种细胞系中均显著上调。在这3种抗原中,上调最明显的为CD9,其在U937中的平均荧光强度可达对照组的10倍左右。转录组测序显示,在15个常见和6个潜在的AML免疫治疗靶点中,除CD9、CD38、CD123明显上调外,还有5个靶点（CCR1、CLL-1、CD70、SIGLEC6、CD117）在地西他滨处理后的2种细胞系中明显上调,而白细胞免疫球蛋白样受体家族B成员LILRB2在地西他滨处理后的3种细胞系中均明显上调。GO、KEGG富集分析显示,3种细胞系的共同DEGs主要富集在免疫相关的生物学过程和信号通路。进一步对每种细胞系进行GSEA富集分析显示,细胞因子-细胞因子受体相互作用、白介素、炎症反应、淋巴细胞与非淋巴细胞的免疫调节相互作用等信号通路在3种细胞系均明显富集并上调。这些提示地西他滨对AML的干预涉及到免疫调控的作用机制。结论地西他滨可以上调CD9、CD38、CD123、LILRB2等多种靶点的表达,提示针对这些靶点采用的免疫疗法与地西他滨存在潜在的协同增效作用。基因富集分析表明地西他滨很有可能通过免疫调节信号通路来增强免疫应答,借助于免疫微环境阻抑AML细胞的增殖。第三部分 LILRBs作为AML免疫治疗靶点的探索目的AML免疫治疗面临的主要问题依然是寻找合适的靶点。本研究的第二部分发现LILRB2可能是AML的潜在靶点,而其他LILRB成员是否可以作为免疫治疗的靶点尚不清楚。因此,本研究的第三部分旨在分析LILRBs基因家族在AML中的表达、预后、进展及免疫抑制中的作用,探究其作为AML潜在免疫治疗靶点的可能性。方法从UCSC Xena数据库下载TCGA-LAML数据集和GTEx中对应正常组织的mRNA数据,比较AML与正常样本间LILRBs基因表达水平的差异。从TCGA数据库下载TCGA-LAML患者的临床信息,比较LILRBs高表达组与低表达组的的生存差异。分别比较TCGA-LAML数据集中LILRB1-4高表达组和低表达组（＜50%vs≥50%）的基因表达,获得DEGs。对DEGs进行GO、KEGG、GSEA功能丰富分析。使用ssGSEA算法评估LAML数据集中24种免疫细胞的富集水平。用Spearman相关分析LILRBs与常见的23个免疫抑制基因表达水平之间的关系。分别筛选出与LILRB1-4呈显著正相关的基因取交集,获得与LILRB1-4均共表达的基因。利用单因素Cox回归分析从这些基因中筛选出与AML预后显著相关的共表达基因,再利用Lasso回归从共中筛选基因建立AML预后风险评分模型。使用单因素和多因素Cox回归评价风险评分模型及常见危险因素的独立预后作用。使用预后独立危险因素建立预后Nomogram图来预测AML患者1年、2年和3年的生存概率。使用Calibration曲线判断Nomogram图的预测效能。使用R语言（v.3.6.3）进行统计分析和作图。结果LILRB1-5在AML中的表达水平显著高于正常对照样本。LILRB1-4的过表达与AML患者预后不良相关。GO、KEGG富集分析显示DEGs主要富集在免疫相关的生物学过程和信号通路。GSEA富集分析显示趋化因子、IL-10等免疫信号通路,MAPK、PI3K-AKT-mTOR等致癌信号通路,细胞粘附分子、白细胞跨内皮迁移、血管内皮生长因子受体等耐药信号通路在LILRB1-4高表达组显著富集。免疫细胞浸润分析显示,与LILRB1-4低表达组相比,LILRB1-4高表达组的免疫抑制细胞如不成熟的DC、肿瘤相关巨噬细胞、Treg细胞富集水平明显升高,而NK细胞富集水平呈明显降低（P＜0.05）。相关性分析也显示,LILRB1-4表达水平与上述免疫抑制细胞的富集水平呈显著正相关,而与NK细胞富集水平呈显著负相关（P＜0.05）。此外,LILRB1-4与大多数免疫抑制分子如TIM-3、CTLA-4、IDO1、IL-10、IL10-R、TGFβ1的表达水平呈显著正相关（P＜0.05）。通过共表达分析、Cox回归以及Lasso回归分析,共筛选出6个基因、DESI1、HTR7、GNGT2、S100A4、TFEB、STIM2)来构建预后风险评分模型。时间依赖性ROC曲线显示,该预后风险评分模型准确性较高,1年、3年、5年时总生存率的曲线下面积分别为0.766、0.762和0.802。多因素Cox分析显示,年龄、预后不良的危险分层、风险评分是AML患者OS的独立危险因素。使用上述独立危险因素构建预后Nomogram图,Calibration曲线证实该Nomogram图对AML患者1年、2年和3年的生存概率具有较强的预测效能。结论LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4在AML中高表达,在AML的进展和免疫抑制微环境的形成中起重要作用,且具有较高的预后价值,很可能成为AML的潜在免疫治疗靶点。针对这些靶点的免疫治疗不仅可以靶向杀伤AML细胞,还有望阻抑AML细胞的免疫逃逸。