肝癌相关抗原HAb18G是一种高度糖基化的膜蛋白分子。通过我室自己制备的抗人单克隆抗体HAb18从肝癌。cDNA文库中筛选得到了其cDNA序列，查询Genbank证实其与CD147分子cDNA序列开放阅读框完全一致，与基质金属蛋白酶诱导剂EMMPRIN（Extrcellular Matrix metalloproteinase Inducer）、Basigin、Nureothelin等为同一蛋白在不同组织细胞的表达。我实验室先前已成功地构建了HAb18G的真核表达载体并在COS-7和CHO细胞中得以稳定和瞬时表达，为进一步对该抗原的研究奠定了基础。但对一种蛋白质的研究除需要有蛋白活性外，还必须制备出大量蛋白以供应用，而真核细胞膜蛋白在分离纯化制备时往往工序复杂，不利于大量制备，而且裂解剂及其他一些物理化学因素可能会引起蛋白质活性或空间结构的改变，给研究工作带来诸多不便。而分泌型蛋白则可以反复从培养细胞的上清中直接获取。应用分子生物学的方法将细胞膜蛋白进行加工，使其成为可分泌型蛋白，无疑会大大简化获取的程序，使大规模制备成为可能。本试验的目的是通过构建HAb18G胞外结构的真核分泌表达载体，实现在COS-7细胞的瞬时表达。为大量获取该蛋白、简化获取程序以及对其生物学功能的研究奠定基础。 第四军医大学硕士学位论文 通过PCR的方法删除HAb18G的跨膜序列和胞内结构域，获得Mb18G的 胞外区结构。限制性内切酶双酶切PCR产物及PCDNA3后，将酶切后的PCR产 物与PCDNA3连接，转染J’’M109大肠杆菌，提取质粒经酶切和测序鉴定后，重 组质粒转染COS－7细胞，收获细胞上清，亲和层析纯化、聚乙H醇浓缩，聚丙 烯酚胺凝胶电泳、。estern blot及斑点杂交鉴定，ELISA定性和半定量检测。 同时COS－7细胞提取总RNA，RT－PCR鉴定表达情况。结果显示：HAb 18G胞外 区真核分泌表达载体构建成功，RT－PCR显示重组质粒在COS－7细胞内表达。 斑点杂交和ELISA均检测到该抗原的存在。SDS－PAGE电泳在45KDa显示该蛋 白的分子量约45KDa。结论：通过删除HAbl8G胞外区结构和跨膜序列，成功 地构建了 HAb SG胞外区片段真核分泌型载体载体。并在 COS－7细胞中得以表 达分泌，所分泌的蛋白保留有抗原活性。