Pod1作为真核细胞中重要的转录因子——bHLH转录因子家族中蛋白质,既能特异识别并结合DNA非编码序列调节下游基因的表达,也能与其他蛋白质相互协同参与哺乳动物性腺发育,肾脏、肺、脾脏、心脏等主要器官的形成,以及肿瘤抑制、机体免疫等多种生命调控。本研究以作者发现的中国鱼类新纪录种——鳍斑青鳉为实验动物,筛选与Pod1相互作用的蛋白质进而推测其可能的功能,研究的主要内容及结果如下:⑴利用日本青鳉的序列信息设计出酶切位点修饰引物,从鳍斑青鳉性腺组织中扩增出pod1、sf1、bmp4、tcf3和hdac1、arα、arβ7个基因编码区片段,克隆至pEASY-T5 Zero载体,并测序得到验证。⑵将克隆至T载体的7个基因编码区片段,通过限制性核酸内切酶酶切,T4 DNA连接酶重新连接,成功构建出7种重组原核表达质粒pET32a(+)-pod1和pGEX5X1-sf1/bmp4/tcf3/hdac1/arα/arβ,并双酶切及测序得到验证。⑶将7种重组原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS和Rosetta(DE3)、OrigamiB(DE3)四种宿主菌株内,在不同的IPTG诱导剂浓度、诱导温度、摇床转速、诱导时间等条件下诱导表达,筛选出最佳的诱导条件,并用6His和GST标签单克隆抗体通过Western blot验证了所表达的融合蛋白。⑷SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色分析表明,Pod1融合蛋白获得很好的表达效果,几乎都是可溶的活性蛋白且占总蛋白的50%以上,包涵体蛋白质极少;而Sf1、Bmp4、Tcf3、Hdac1四种融合蛋白表达形式以可溶性蛋白为主,目的蛋白与宿主菌自身蛋白质相比条带最亮;此外,Arα、Arβ两种蛋白质在多种诱导条件下都没有获得好的表达效果,Western blot显示它们没有表达。⑸使用Ni-NTA树脂从细菌裂解液中得到纯化的Pod1融合蛋白,再用Millipore超滤离心管脱盐处理后充当Prey蛋白,分别与结合了Sf1、Bmp4、Tcf3、Hdac1四种融合蛋白的GST树脂孵育进行GST Pull-down实验,结果表明Pod1融合蛋白与Tcf3、Hdac1融合蛋白能发生相互作用。根据本研究的实验结果,我们推测在鳍斑青鳉中Pod1蛋白质可与bHLH转录因子家族中另一成员Tcf3结合,共同参与某些生命调控;此外,在鳍斑青鳉中Pod1可能借助组蛋白去乙酰化酶Ⅰ(Hdac1)调节下游基因的表达。