【摘 要】
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目的本次研究的目的是探讨LINC00858在宫颈癌细胞中的生物学功能及其相关作用机制。方法为了探究LINC00858在宫颈癌细胞的表达情况,首先,培养人正常宫颈上皮细胞系（Ect1/E6E7）和四个宫颈癌细胞系（CaSki、SiHa、ME180、MS751）,用RT-qPCR实验检测五个宫颈细胞系中LINC00858的表达情况。根据检测结果,筛选出LINC00858表达量最高的两个宫颈癌细胞系ME
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目的本次研究的目的是探讨LINC00858在宫颈癌细胞中的生物学功能及其相关作用机制。方法为了探究LINC00858在宫颈癌细胞的表达情况,首先,培养人正常宫颈上皮细胞系（Ect1/E6E7）和四个宫颈癌细胞系（CaSki、SiHa、ME180、MS751）,用RT-qPCR实验检测五个宫颈细胞系中LINC00858的表达情况。根据检测结果,筛选出LINC00858表达量最高的两个宫颈癌细胞系ME180和MS751,作为后续实验研究对象;应用 starBase、miRmap、PicTar、TargetScan 和 microT 数据库以及 RT-qPCR实验筛选LINC00858下游潜在的系列靶基因（miR-3064-5p、VMA21）和相应的结合位点。为了进一步研究究LINC00858、miR-3064-5p、VMA21对宫颈癌细胞的生物学作用及其作用机制,构建了特异性靶向LINC00858、VMA21 的sh-RNAs和control-shRNAs,以及 miR-3064-5p 模拟物、miR-3064-5p 抑制剂、和 VMA21 的过表达质粒,分别转染宫颈癌细胞系ME180和MS751,然后用RT-qPCR实验检测转染后的宫颈癌细胞中LINC00858、VMA21、miR-3064-5p的表达情况;EdU和集落形成实验评估敲低或过表达LINC00858、miR-3064-5p、VMA21的宫颈癌细胞的增殖情况,TUNEL和流式细胞术检测评估细胞的凋亡情况;亚细胞分离试验和荧光原位杂交技术（FISH）分析LINC00858在细胞中的定位。通过RNA下拉实验、双荧光素酶报告基因检测和RNA免疫沉淀反应（RIP）检测研究LINC00858、miR-3064-5p和VMA21在宫颈癌细胞中的相互作用。最后,我们又进行了一系列回复实验,进一步验证LINC00858、miR-3064-5p 与 VMA21之间的相互作用及其相关作用机制。结果 正常宫颈上皮细胞细胞相比,LINC00858在四种宫颈癌细胞中均高表达。转染了 sh-LINC00858的宫颈癌细胞中,LINC00858的RNA水平表达明显下降,进而有效地抑制了宫颈癌细胞的增殖并促进细胞凋亡。细胞定位技术确定LINC00858主要位于宫颈癌细胞质内,少虽位于细胞核内,推测LINC00858卞要在转录后调控水平发挥作用。利用数据库查询、RT-qPCR实验及生物信息学分析,结果显示,miR-3064-5p在宫颈癌细胞表达较低,可以选取miR-3064-5p作为LINC00858的候选靶点。而VMA21在所有的候选mRNA中,其在宫颈癌细胞中表达最高,故选取VMA21作为miR-3064-5p的候选靶点。miR-3064-5p作为潜在的miRNA可能同时与LINC00858及VMA21结合。荧光素酶报告试验和RIP进一步研究证实了miR-3064-5p与LINC00858在宫颈癌细胞中相互结合。RNA下拉试验和荧光素酶报告试验表明,VMA21是miR-3064-5p的直接作用靶点,二者相互作用。相较于空白对照组,转染了 VMA21过表达质粒的宫颈癌细胞中,VMA21的表达明显增高。相反,转染了 sh-VMA21的宫颈癌细胞中,VMA21的表达明显受到抑制,敲低VMA21后使ME180和MS751宫颈癌细胞增殖能力降低,并促使细胞凋亡率增高,以上表明VMA21使宫颈癌细胞增殖并抑制宫颈癌细胞凋亡。一系列回复实验表明,miR-3064-5p下调和VMA21上调均能够抵消LINC00858的降低对宫颈癌细胞的增殖和凋亡的影响。结论1.LINC00858通过竞争性吸附miR-3064-5p,与之结合,抑制miR-3064-5p的表达,使下游靶分子VMA21表达上调,从而促进宫颈癌细胞增殖,抑制宫颈癌细胞凋亡。2.LINC00858能够通过靶向调节miR-30645p/VMA21轴,抑制宫颈癌细胞凋亡,促进宫颈癌细胞增殖,这表明LINC00858有望成为宫颈癌治疗的潜在新靶点。
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