脑卒中、癫痫、脑肿瘤、神经退行性疾病等急慢性神经损伤都被证明与N-甲基-D-门冬氨酸受体(NMDAR,NR)介导的神经兴奋毒性有关。通过选择性干预NMDA受体过度激活所介导的神经兴奋毒性,为上述若干致死、致残性疾患提供有效的防治手段是近20多年来基础与临床神经科学始终追求的一个重要目标。然而,现有的NMDA受体拮抗剂或阻断剂因严重的毒副作用和有限的临床疗效始终未能在临床治疗中取得成功。兴奋毒性脑损害免疫防治策略在该领域是一项全新的探索:以NMDA受体为免疫原,对上述脑疾患高危人群予以自身免疫干预,打破自身免疫耐受,建立抗NMDA受体的特异性体液免疫反应,当诱导产生的自身抗体与NMDA受体结合后会干预其过度兴奋,从而达到防治目的。由于过长的蛋白质抗原作为免疫原会对机体产生潜在的细胞毒性危害,因此构建抗原表位亚单位疫苗是最理想的选择,而表位的选择是疫苗设计的关键。为解决此问题,本课题对人NMDA受体主亚基NR1a膜蛋白的两个胞外区片段——胞外氨基端和M3-M4环进行了分析,认为以M3-M4环作为免疫干预的靶点可能更为安全有效,并从中筛选出了一个自身免疫优势性表位,共聚焦显微镜下观察到针对这个表位的单克隆抗体具有抗兴奋毒性神经保护效应。主要实验内容如下:一.人NR1a膜蛋白自身免疫优势性表位的生物信息学分析通过对以往相关实验资料的研究分析表明,在免疫干预过程中,NR1a膜蛋白的M3-M4环与胞外氨基端相比,可能更容易诱导产生安全有效的免疫反应。为避免以过长分子作为免疫原所导致的细胞毒性危害,在M3-M4环上筛选出一个自身免疫优势性表位,打破自身免疫耐受而实现安全、可控的免疫干预效果便成了问题的关键。近几年生物信息学的飞速发展使异源分子B细胞表位的预测准确率有了很大提高,但对于自身分子,至今尚未有成熟的B细胞表位预测方法出现。本<WP=5>研究在对免疫原提呈途径深入了解的基础上,利用异源分子B细胞表位预测软件GOLDKEY及相关的生物信息学分析数据库,从B细胞表位、细胞毒性T细胞表位、辅助性T细胞表位、蛋白酶体剪切位点、内体/溶酶体蛋白酶剪切位点、糖基化位点、二级结构七个方面对自身分子进行自身免疫优势性表位的综合分析。为验证这套综合预测方法的可靠性,我们对自身免疫优势性表位已知的40种自身免疫分子做了分析,结果显示,这套方法的预测准确率达到70%以上,远远高于其他生物信息学表位预测方法的准确率。随后我们用这套方法对人NR1a膜蛋白的M3-M4环进行分析,从中筛选出了一个自身免疫优势性表位R(22)LRNPS。二.人NR1a膜蛋白自身免疫优势性表位单克隆抗体抗兴奋毒性作用研究Mab363是针对NR1a膜蛋白M3-M4环的特异性单克隆抗体,用mAb363筛选噬菌体展示随机12肽库得到的表位与本研究中用生物信息学方法确定的自身免疫优势性表位完全相符。为验证用此表位进行自身免疫干预的安全有效性,本研究组做了体外神经保护实验,结果表明它的确具有明显的抗谷氨酸兴奋毒性作用。为进一步验证此结论并探讨mAb363神经保护作用的机制,我们原代培养新生大鼠海马神经元,在培养第12天,用Ca2+荧光探针Fluo-3/AM标记细胞内游离Ca2+,并分别以mAb363及经典的NMDA受体非竞争性拮抗剂MK-801预处理海马神经元,激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)下观察二者对谷氨酸诱发细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)升高的影响。结果显示,mAb363能显著抑制谷氨酸所致海马神经元[Ca2+]i升高,此作用强于MK-801,且其本身对生理状态下神经元[Ca2+]i无影响。提示mAb363的抗兴奋毒性作用是通过改变NMDA受体的蛋白质二级结构从而影响兴奋毒性作用中的Ca2+内流实现的。综上所述,本研究首先选定人NR1a膜蛋白的M3-M4环作为自身免疫干预的靶片段,并建立了一套自身免疫优势性表位的生物信息学分析方法,经验证此方法具有较高的预测准确率后,对人NR1a膜蛋白M3-M4环靶片段进行了综合分析判定,筛选出了其中的一个自身免疫优势性表位,并应用激光扫描共聚焦显微镜来观察针对这个表位的单克隆抗体mAb363对谷氨酸诱导的细胞外Ca2+内流的影响,进一步证实了以此表位做免疫原进行自身免疫干预的安全有效性,同时对其抗兴奋毒性机制进行了初步的探讨,为下一步构建抗原表位亚单位疫苗提供了重要的理论和实验基础。