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试验以东方百合杂种系品种西伯利亚和索蚌为试材,通过鳞片培养的无菌苗,研究了百合叶片离体再生不定芽的主要影响因素,建立了高频稳定的百合叶片再生体系。试验研究了农杆菌介导的百合遗传转化的主要影响因素,建立了有效的转化体系,获得了西伯利亚百合转葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase,GO)基因的转化植株。具体结果如下:
百合鳞片培养过程中,最佳诱导培养基为MS+BA1mg/L+NAA0.5mg/L+GA30.05mg/L,诱导率达70.4%。东方百合鳞片培养时选用外层或者中层鳞片为宜,诱导率达77.1%,鳞片下部诱导效果优于中部和上部,西伯利亚和索蚌的诱导率分别为69.1%和59.5%。鳞片近轴面向上培养效果较好,诱导率为77.8%。
在离体叶片再生体系研究中,分析了外源激素、碳源、外植体、AgNO3等因素对诱导不定芽的影响。结果表明,激素构成和浓度对不定芽再生率有明显影响。西伯利亚百合叶片最佳诱导培养基为MS+BA2mg/L+ZT1mg/L,再生率达100.0%,平均单叶再生不定芽数为1.06,芽质量较好。诱导培养基添加5-7.5mg/LAgNO3能够促进再生不定芽,添加AgNO3后植株生长健壮、叶片宽厚,基部结鳞茎,并生成大量不定根。暗培养能促进不定芽的再生,但长时间暗培养会导致幼苗细弱,暗培养时间以7-14天为宜。碳源对诱导不定芽影响不明显,葡萄糖比麦芽糖和蔗糖诱导率稍高,但无显著差异。百合试管苗培养最佳生根培养基为MS+NAA0.75mg/L,生根率达98.5%,西伯利亚百合平均单株生根数为4.13条,索蚌3.96条,根系粗壮、根毛丰富。
试验研究了影响百合转化的因素,初步建立了百合的遗传转化体系,并将GO基因成功转入百合。百合叶片对抗生素G418和卡那霉素反应较敏感,培养基中添加G418幼芽生长迟缓、生长状态不良,不宜用做抗性芽筛选的鉴定指标;添加卡那霉素对幼芽生长影响较小,可用作百合抗性芽的筛选,当卡那霉素浓度达120mg/L时叶片再生率为5%,可作为筛选的适宜浓度指标。百合对羧苄青霉素适应性较强,羧苄青霉素浓度为300-400mg/L时可抑制农杆菌生长,但对百合不定芽分化无明显影响,可以作百合转化抑菌抗生素的浓度指标。
试验研究了农杆菌侵染百合的适宜转化体系。结果表明,取苗龄40天的试管苗新展开叶片,接种于不定芽诱导培养基预培养2d,用携带目的基因的农杆菌LBA4404侵染15-30min(农杆菌的浓度约为OD=0.8)。侵染后共培养3-7天,培养基为MS+AS200mg/L+BA2mg/L+ZT1mg/L(MS培养基除去大量元素NH4NO3),直到肉眼可见淡淡的白色菌斑时,将外植体移入选择培养基中筛选抗性芽。选择培养两周继代一次,70天后可得抗性植株。百合对农杆菌敏感性较差,转化率偏低但脱菌处理较容易。
经反复筛选,获得了7株抗性植株。试验采用CTAB法提取百合总DNA,以GO基因内部序列设计引物进行PCR扩增,7株抗性植株中有3株呈阳性。试验对PCR阳性植株进行了Southern印记杂交,有1株呈阳性,表明目的基因已整合到百合基因组中。试验通过“淀粉—碘化钾”染色反应,初步证明转化基因已在受体植株获得表达,产生了葡萄糖氧化酶。