糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常见、最严重的微血管并发症之一,也是导致终末期肾衰竭的主要原因之一。肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cells,GMCs)和足细胞是肾脏中最重要的两种固有细胞,其功能的改变在DN的进程中起着至关重要的作用。课题组前期研究发现,高糖状态下GMCs和足细胞之间可能存在相互作用,这种相互作用对DN的发生发展可能具有重要的意义,但其具体机制尚不明确,需要更进一步探讨。外泌体是由细胞分泌的一种微囊泡,研究表明外泌体可以携带多种蛋白质、脂质、mi RNA,参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生、炎症反应和肿瘤生长等过程。在高糖刺激下,肾小球内皮细胞分泌的外泌体能够激活GMCs,促进肾间质纤维化,提示肾脏中固有细胞之间的相互作用可以通过外泌体实现。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)是一种胞内磷脂酰肌醇激酶,是诸多生命活动中关键的信号分子。蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)是PI3K下游直接的靶蛋白,属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是PI3K/AKT信号转导通路的核心。小檗碱(berberine;BBR)是黄连根茎中的主要成分为,研究表明,BBR具有降低血糖、调节异常脂质代谢、抗炎、改善胰岛素抵抗及减轻肾脏损伤的作用。上述研究表明,在高糖状态下足细胞和GMCs之间相互作用可能对DN发生和发展产生重要影响。而两种细胞的相互作用是通过何种途径来实现及对如何对足细胞产生作用进而影响整个DN的进程,目前尚不清楚,本课题拟通过分离GMCs来源的外泌体作用于足细胞,对GMCs与足细胞之间相互作用的具体途径进行研究从而了解其对DN的发生和发展机制的过程的影响。同时,研究BBR对高糖诱导GMCs来源外泌体对足细胞作用的影响,以期探讨BBR对DN靶细胞的治疗作用及其可能的作用机制。目的:明确外泌体是否能够参与GMCs与足细胞之间的相互作用。明确BBR对高糖诱导GMCs来源外泌体损伤足细胞的保护作用。进一步探究BBR对高糖诱导GMCs来源外泌体对足细胞损伤的保护作用的具体机制和重要的分子靶点;为合理开发利用BBR防治DN提供理论依据,并且为探索新的治疗DN药物开拓新的研究方向和思路。方法:通过Transwell小室共培养GMCs和足细胞,将GMCs置于小室上层,足细胞置于小室下层,分为正常组(NG),高糖模型组(HG)和GW4869(外泌体抑制剂)组,各组给予相应刺激后,在小室中共培养24 h,收集下室中肾小球足细胞,利用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒检测足细胞凋亡情况,黏附功能实验检测足细胞黏附能力,利用Western blot法检测nephrin、podocin和WT-1蛋白的表达的情况并观察外泌体能否介导GMCs与足细胞之间的相互作用。利用超速离心法分离GMCs来源的外泌体,使用透射电镜观察外泌体的形态和大小;Western blot法检测外泌体的标志蛋白CD63、TSG101和分子伴侣蛋白Calnexin的表达;利用马尔文粒径分析仪检测外泌体的粒径分布;利用PKH67标记外泌体,然后与足细胞共同孵育,利用激光共聚焦显微镜观察外泌体的摄取。CCK-8法确定BBR对GMCs的适宜刺激浓度,将分离得到的外泌体分别作用于足细胞,利用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒检测足细胞凋亡情况;黏附功能实验检测足细胞黏附能力;利用Western blot法检测nephrin、podocin和WT-1蛋白的表达的情况;免疫荧光实验观察足细胞上TGFβ1R的表达,观察BBR能否减轻高糖诱导GMCs来源外泌体对足细胞对损伤。利用小干扰RNA沉默GMCs上转化生长因子(transforming growth factor-β1;TGFβ1)的表达,分离得到各组外泌体,用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno sorbent assay;ELISA)检测各组外泌体中TGFβ1的含量,将各组外泌体分别作用于足细胞,利用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒检测足细胞凋亡情况;黏附能力实验检测足细胞黏附功能;利用Western blot法检测nephrin、podocin和WT-1蛋白的表达的情况;利用Western blot法检测PI3K、AKT、P-AKT、P65、P-P65、转化生长因子1受体(transforming growth factor-β1 receptor;TGFβ1R)等信号通路蛋白的表达水平。结果:1.GMCs培养上清液中成功分离出外泌体透射电镜下可见分离得到的外泌体呈现典型的杯口状,直径在50-150nm,符合文献中报道的外泌体典型特征。Western blot检测结果显示所得外泌体表达CD63和TSG101,但是内质网分子伴侣Calnexin不表达,进一步证明上清液分离得到的为不含细胞成分的外泌体。共聚焦显微镜观察结果显示,PKH67标记后的外泌体能够被肾小球足细胞所摄取。2.高糖诱导GMCs来源的外泌体参与足细胞损伤的过程与正常组相比,高糖模型组的足细胞凋亡率显著增加,黏附能力显著降低,足细胞上nephrin、podocin和WT-1蛋白的表达水平显著下调,与高糖模型组相比较,GW4869(外泌体抑制剂)组中上述指标均有显著改善。3.BBR显著改善高糖诱导GMCs来源外泌体对足细胞的损伤CCK-8细胞增殖实验结果显示,高糖刺激状态下GMCs过度增殖,BBR具有显著的抑制GMCs增殖作用,根据此结果,设定后续GMCs的给药浓度为50μmol/L和100μmol/L。与正常组相比,高糖模型组足细胞凋亡率显著增加,黏附能力显著降低,足细胞上nephrin、podocin和WT-1蛋白的表达水平显著下调,与高糖模型组相比较,BBR高低浓度组能不同程度改善上述指标。4.小檗碱减轻高糖诱导GMCs来源外泌体对足细胞的损伤可能与TGFβ1R-PI3K/AKT信号通路相关免疫荧光实验观察足细胞上TGFβ1R的表达,与正常组相比,高糖组足细胞上TGFβ1R的表达显著升高,与高糖组相比,BBR组能显著降低足细胞上TGFβ1R的水平。利用小干扰RNA沉默GMCs上TGFβ1的表达,分离得到的各组外泌体,用ELISA检测各组外泌体中TGFβ1的含量,结果显示与正常组相比,高糖组外泌体中TGFβ1含量显著升高,与高糖组相比,BBR组和TGFβ1基因沉默组TGFβ1含量均显著下降,BBR与TGFβ1基因沉默共同作用组中TGFβ1含量降低更为显著。将各组外泌体分别作用于足细胞,利用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒检测足细胞凋亡情况,结果显示与正常组相比,高糖组中足细胞凋亡率显著升高,与高糖组相比,BBR组和TGFβ1基因沉默组足细胞凋亡率显著降低,BBR与TGFβ1基因沉默共同作用组中足细胞凋亡率降低更为显著。黏附能力实验检测足细胞黏附功能,结果显示与正常组相比,高糖组中足细胞黏附能力显著降低,与高糖组相比,BBR组和TGFβ1基因沉默组足细胞黏附能力显著升高,BBR与TGFβ1基因沉默共同作用组中足细胞黏附能力升高更为显著。利用Western blot法检测nephrin、podocin和WT-1蛋白的表达的情况;结果显示与正常组相比,高糖组中足细胞nephrin、podocin和WT-1蛋白的表达水平显著降低,与高糖组相比,BBR组和TGFβ1基因沉默组中足细胞上nephrin、podocin和WT-1蛋白的表达水平显著升高,BBR与TGFβ1基因沉默共同作用组中足细胞上nephrin、podocin和WT-1蛋白的表达水平升高更为显著。利用Western blot法检测PI3K、AKT、P-AKT、P65、P-P65、TGFβ1R等信号通路蛋白的表达水平,结果显示与正常组相比,高糖组中足细胞上PI3K、P-AKT、P-P65、TGFβ1R表达水平显著升高,与高糖组相比,BBR组和TGFβ1基因沉默组足细胞上PI3K、P-AKT、P-P65、TGFβ1R表达水平显著降低,BBR与TGFβ1基因沉默共同作用组中足细胞上PI3K、P-AKT、P-P65、TGFβ1R表达水平降低更为显著。结论:1.外泌体可以介导GMCs与足细胞之间的相互作用。2.BBR可以改善高糖诱导GMCs来源的外泌体对足细胞的损伤。3.BBR可能通过外泌体调节TGFβ1R-PI3K/AKT通路发挥对足细胞的保护作用