半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)隶属于鲽形目((Pleuronectoidei),身体呈舌状、左右不对称,两眼位于身体同一侧,多匍匐于水底或身藏在泥沙内而眼外露,习惯夜间觅食。由于其个体大、生长速度快、出肉率高,肉质细嫩,味道鲜美,高蛋白低脂肪,经济效益高,已成为我国增养殖对象的首选。在其人工养殖过程中,因其特殊的生活习性,导致其摄食率低,生长缓慢等问题,严重制约其推广养殖。先前研究证实半滑舌鳎具有发达的皮肤感觉器官——侧线系统,行为学实验结果表明在其摄食过程中,侧线系统起主导作用,且头部的侧线系统在半滑舌鳎摄食过程中发挥重要的作用。同时,先期研究发现与以往文献“半滑舌鳎无眼侧被似圆鳞的弱栉鳞”不同的是半滑舌鳎头部无眼侧无鳞,侧线系统发达,存在大量游离神经丘。半滑舌鳎游离神经丘形态特征及功能有待于深入研究,为进一步探索其感觉功能与行为等提供理论依据,同时也能为其他鲽形目鱼类养殖开发提供借鉴与指导。1.半滑舌鳎游离神经丘形态分布及发育特征在半滑舌鳎个体发育过程中,(1)游离神经丘分布变化:10日龄仔鱼游离神经丘已出现在眼睛和嗅孔周围,变态完成伏底生活后,40日龄稚鱼游离神经丘数量急剧增加且已布满整个无眼侧头部,成鱼期游离神经的数量更密集,且在前嗅孔周围密集程度最高;在40日龄时游离神经丘的分布是呈线性的,游离神经丘是单个存在的,到50日龄稚鱼期其分布就变得无规则且杂乱,由于其周围皮肤皱褶的存在,游离神经丘变得成簇存在,半滑舌鳎成鱼游离神经丘成簇存在,无规则杂乱分布在无眼侧头部。(2)游离神经丘形态变化:游离神经丘顶部胶质顶由圆筒状变为扁担状,其顶部形状也从圆形变为四角星型,存在与顶部的感觉板也由圆形变为长条形。研究推测10日龄半滑舌鳎仔鱼的游离神经丘的存在能够协助在其眼睛还没有发育完全的状态下定位和摄食食物;变态完成后无眼侧头部大量的游离神经丘分布,有利于其感知周围水流变化适应底栖生活。游离神经丘杂乱密集的分布以及其形态的变化能够加强其对周围环境的敏感性,有利于其感知水流运动,协助摄食或避敌。综上所述,推测半滑舌鳎游离神经丘在其摄食感觉功能中发挥重要作用。2.半滑舌鳎trp通道超家族克隆及cstrpv4组织表达研究本文首次从半滑舌鳎中克隆获得6个trp家族基因序列,经鉴定与机械感觉相关的有4个:trpv4、trpv1、trpc1和trpm7;与化学感觉相关的有2个:trpm5和trpp3。通过race技术克隆得到trpv4基因全长,其cdna全长为3104bp,包括一个2613bp的开放阅读框,编码870个氨基酸,5’上游区有一段非编码区(utr)区域大小为237bp,3’下游区有一段大小为254bp的utr区,并且3’-utr包含poly-a尾巴,该cdna能够完整编码一个蛋白质,其蛋白分子量约为98.75kda等电点为8.07。氨基酸序列预测包括6个跨膜区(transmembrane,tm)(tm1-tm6)和位于t5与t6区之间的孔道环(poreloop,pl)结构,通道蛋白的氨基端存在4个锚连蛋白重复区(ankyrinrepeatdomains,ank)和核蛋白定位信号序列(nuclearlocatlizationsignalsequence,nls),羧基端存在trp结构域(trpdomains)和钙调蛋白结合域(calmodulinbindingdomains,cambd)。同源序列分析表明与其他物种的trpv4存在高度的同源性,与与深裂锯眶雀鲷、罗非鱼、鲈鱼、斑马鱼、热带爪蟾、大鼠、小鼠和人的trpv4序列分别有90.1%,84.8%,81.0%,77.1%,74.1%,72.4%、72.4%和72.9%的一致性。系统进化树研究结果表明(包括半滑舌鳎),所有脊椎动物聚为一簇,线虫聚为一簇;脊椎动物中,所有的硬骨鱼聚为一簇,其他聚为一簇。所有的哺乳动物都聚在一簇,同属内种间亲缘关系表现为最近,例如大鼠和小鼠。这一结果正确的反应了所选物种间的进化关系。研究了cstrpv4在其各个组织mrna的表达模式。结果表明cstrpv4在各个组织广泛表达,心脏中表达量最高,且与其他组织表达差异显著;在脾脏和眼睛中表达次之;在精巢中表达显著高于肾脏和肝脏;进一步研究了cstrpv4在其六个感觉器官表达模式,眼睛表达最高,游离神经丘表达次之且显著高于其他感觉器官。研究推测cstrpv4在眼睛中大量的表达可能与其感受外界水流压力有关;cstrpv4在游离神经丘中较高的表达,可能发挥其机械感觉功能,并在摄食中发挥作用。综上,trp超家族在感觉生理中有极其重要的作用,半滑舌鳎中存在的trp家族种类及表达分布情况,能够为其感受器感觉功能属性的界定提供了新的思路和方法。3.半滑舌鳎cstrpv4在游离神经丘定位及机械感觉功能研究trpv4是目前公认的具有机械感觉功能的蛋白通道。半滑舌鳎中游离神经丘中cstrpv4的存在、基因定位及功能分析,可以为鱼类游离神经丘感觉属性界定提供理论依据,完善鱼类侧线系统的功能研究;同时也有助于半滑舌鳎养殖技术的改进与发展。本文首次从分子水平分析与探讨游离神经丘的功能。(1)原位杂交结果显示cstrpv4的存在于1日龄半滑舌鳎仔鱼和5月龄半滑舌鳎的游离神经丘中,在游离神经丘的套细胞、感觉细胞和特有柄状结构都有表达。(2)通过rna干扰技术干扰降低游离神经丘中cstrpv4的表达,观测其对摄食行为的影响。结果显示干扰组相较于侧线封闭组,对头部前方低频的振动源攻击率显著降低,相较于游离神经丘封闭组却显著提高;表明cstrpv4基因表达量的降低,在一定程度上影响游离神经丘对头部前方低频振动小球的感觉定位,在游离神经丘中发挥着机械感觉功能,同时行为学研究发现半滑舌鳎头部无眼侧游离神经丘在其摄食过程中,尤其在摄食头部前方低频食物时发挥主要作用,显著高于侧线对其作用。4.半滑舌鳎与其他五种鲽形目鱼类无眼侧皮肤形态比较及摄食相关性功能探采用扫描电镜技术首次对半滑舌鳎及其他五种鲽形目鱼类的无眼侧头部皮肤可能存在的感觉器官进行观察比较研究,以期获得与摄食行为等生态习性相关的新发现,为其在养殖生产过程中,选择和制作合适的饵料和选择合理的投喂方式提供理论依据,以期获得与摄食行为等生态习性相关的新发现。结果显示,半滑舌鳎和塞内加尔鳎(soleasenegalensis)的无眼侧头部皮肤存在大量游离神经丘,但其形态特征存在差异。半滑舌鳎皮肤表面的游离神经丘类似于乳头状突起,突起上有表皮细胞形成的微脊,多个为一簇,很少单独存在,呈无规则排列;而塞内加尔鳎的游离神经丘直接裸露在皮肤表面,呈线性排列在肉芽状皮肤突起的下方。星突江鲽(platichthysstellatus)的头部无眼侧皮肤表面零散分布着多个为一簇的游离神经丘,形状类似于半滑舌鳎的乳头状游离神经丘。大菱鲆(scophthalmusmaximus)、黄盖鲽(Pseudopleuronectes yokohamae)和条斑星鲽(Verasper moseri)的头部无眼侧皮肤表面没发现游离神经丘等特殊结构,但其表面都凹凸不平。研究推测鲽形目鱼类头部无眼侧皮肤形态特征影响其摄食行为,其游离神经丘的密集程度与其摄食习性密切相关;其头部无眼侧游离神经丘的分布特征与种群分类存在一定的相关性,可为物种的分类提供一定的依据。综上所述,本研究首次阐述了半滑舌鳎游离神经丘形态分布及发育特征,分析比较了半滑舌鳎与其他5种鲆鲽鱼类无眼侧皮肤形态,证实头部无眼侧游离神经丘与其摄食习性密切相关。首次在游离神经丘上定位到Cstrpv4的存在,并通过RNA干扰与行为学实验证实CsTrpv4在游离神经丘中发挥机械感觉功能,本研究为阐述鱼类游离神经丘功能提供了可靠且有力的理论依据,同时也为鱼类摄食感觉相关的研究提供基础材料和参考。