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石斛是兰科(Orchidaceae)石斛属（Dendrobium）多年生草本植物，我国石斛属植物有74种2变种。石斛作为药用植物，其种类繁多，不同石斛其药用成分和药理作用不尽相同，如何从分子水平对这些种间和种内的石斛进行有效的鉴别是石斛研究领域的热点问题之一。为探讨多DNA序列组合策略在石斛种间和种内分子鉴别中的应用价值，本研究采用直接测序法对12种石斛叶绿体psbA-trnH基因间隔区序列和核糖体5S rRNA基因间隔区序列进行测序，用克隆测序法对叠鞘石斛dq-2品种和dq-5品系叶绿体psbA-trnH基因间隔区序列进行测序，所得序列先用Squencher4.14拼接后，再用Bioedit7.0软件对获得的叶绿体psbA-trnH基因间隔区序列和核糖体5S rRNA基因间隔区序列进行序列比对和排序，用Dnasp5.0软件分析序列核苷酸多态性，用MEGA5.2计算种内和种间kimura2-parameter(K2P)遗传距离，并构建系统发育树(NJ树)，以期通过叶绿体psbA-trnH基因间隔区序列和核糖体5S rRNA基因间隔区序列的组合分析为石斛属植物及药材鉴别提供分子依据。主要研究结果如下: (1)建立了12种石斛叶绿体psbA-trnH基因间隔区序列数据库，叶绿体psbA-trnH基因间隔区序列平均长度为742.3bp，GC％含量为34.61％，有72个变异位点，其中信息位点33个，嘌呤的转换颠换率为k1=1.477，嘧啶的转换颠换率为k2=0.964;除了碱基颠换和转换的遗传变异外，还有碱基的插入和缺失;psbA-trnH基因间隔区序列在12种石斛中有11种单倍型(h)，单倍型多样性指数(Hd)为0.808，核苷酸多样性指数(Pi)为0.01003。 (2)建立了12种石斛的核糖体5S rRNA基因间隔区序列数据库，核糖体5SrRNA基因间隔区序列平均长度为336.4bp，GC％含量为59.03％，有213个变异位点，占该序列长度的63.32％，其中信息位点为139个，占该序列长度的41.32％;嘌呤的转换颠换率为k1=1.731，嘧啶的转换颠换率为k2=1.459;此外，该序列在12种石斛中有22种单倍型(h)，单倍型多样性指数(Hd)为0.982，核苷酸多样性指数(Pi)为0.17335。 (3)通过叶绿体psbA-trnH基因间隔区序列比较分析了各材料间的遗传距离和碱基差异，石斛属与外类群密花石豆兰的遗传距离为0.050，石斛种间平均遗传距离是0.013;能够区分铁皮石斛、细茎石斛、金钗石斛、尖刀唇石斛、细叶石斛、球花石斛、齿瓣石斛、鼓槌石斛和叠鞘石斛9种石斛;此外，叠鞘石斛dq-2品种和dq-5品系在psbA-trnH基因间隔区全长序列的第131位点处存在A/T碱基颠换，即，叠鞘石斛dq-2品种在第131位为A，叠鞘石斛dq-5品系131位点均T，这是首次在叠鞘石斛中发现一个能将叠鞘石斛中dq-2品种和dq-5品系进行有效区分的单核苷酸多态性位点（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）。 (4)5S rRNA基因间隔区序列在12种石斛种间遗传距离范围是0.003～0.427，平均种间遗传距是0.249，远小于外类群白芨与12种石斛最小的遗传距离0.961，5S rRNA基因间隔区序列能将石斛属植物与外类群区分开;该片段能够区分叠鞘石斛、细叶石斛、球花石斛、齿瓣石斛、细茎石斛、鼓槌石斛、铁皮石斛、尖刀唇石斛和金钗石斛等9种石斛;5S rRNA基因间隔区序列在不同居群间的铁皮石斛样品间存在6处变异位点，铁皮石斛不同居群间的遗传距离在0.002～0.010之间;5S rRNA基因间隔区序列在叠鞘石斛两种品种dq-2和dq-5间的遗传距离是0.018，该序列在dq-2和dq-5间共有13个变异位点。 (5)本研究将叶绿体psbA-trnH基因间隔区序列和5S rRNA基因间隔区序列组合用于构建12种石斛的NJ聚类树，该聚类树能对叠鞘石斛、铁皮石斛、球花石斛、细叶石斛、细茎石斛、齿瓣石斛、鼓槌石斛、尖刀唇石斛和金钗石斛等9种石斛进行有效鉴别，并且聚类树各分支的支持率相对两个单基因片段建树时都有所增大，表明两片段组合策略可使石斛种间鉴别结果的可信度进一步增高。此外，本实验中通过对核糖体5S rRNA基因间隔区序列和叶绿体psbA-trnH基因间隔区序列的组合分析，不仅可以揭示铁皮石斛不同居群间的差异，还可以鉴别叠鞘石斛dq-2品种和dq-5品系，表明组合序列在石斛种内鉴别中可互为补充。 综上所述，叶绿体psbA-trnH基因间隔区序列和核糖体5S rRNA基因间隔区序列在石斛的多片段组合分子鉴别中表现出应用潜力。