研究背景糖尿病和终末期肾脏病(end-stage renal disease ESRD)患者体内往往存在脂质代谢紊乱和晚期糖基化终末产物(advanced glycation end-products AGEs)水平异常增高。流行病学调查发现,脂质代谢紊乱(包括高密度脂蛋白HDL降低,低密度脂蛋白(low density lipoprotein LDL)升高,胆固醇TC和甘油三酯TG升高)以及AGEs(包括各种白蛋白、脂蛋白以及β-微球蛋白等糖基化产物)升高,往往预示着心血管事件发生率增加和死亡率升高等。糖基化修饰的蛋白质将主要通过单核/巨噬细胞表面的AGE受体(RAGE)或CD36受体被摄取、降解。在糖尿病、终末期肾脏病等病理条件下,由于糖化反应加速或糖化产物清除障碍,糖基化修饰蛋白在体内大量蓄积,并通过血管内皮细胞等组织细胞表面RAGE或CD36受体的介导,刺激促炎症介质释放,导致血管等组织损伤。实验证实AGEs可刺激人脐静脉内皮细胞和人外周血单核细胞表达单核细胞趋化蛋；并且AGEs可以促进肾小球系膜细胞及肾小管上皮产生TNF-α和IL-1β；AGE-RAGE相互作用可导致氧化应急反应,激活NF-KB和AP-1等核转录因子,介导VCAM-1、MCP-1等基因的表达。脂质代谢紊乱,尤其是血浆中LDL的升高,常会形成一些氧化和糖基化LDL如氧化修饰的oxLDL、糖基化修饰的AGE-LDL (advanced glycation end-product of low density lipoprotein AGE-LDL)、弱氧化修饰nmLDLL等。这些被修饰的LDL常常可以有比脂质本身更加强烈的病理生理作用。在肾脏疾病中,其可以损伤内皮细胞及肾小球基底膜、诱导血小板聚集、诱导单核巨噬细胞浸润及泡沫细胞形成、导致系膜细胞增殖和细胞外基质积聚增加、影响花生酸类似物的产生和释放,加重和加快肾脏疾病的发生发展。终末期糖基化低密度脂蛋白是低密度脂蛋白经过糖基化修饰后得到的产物,其可以触发细胞凋亡,减少一氧化氮合成,介导VCAM-1和巨噬细胞清道夫受体表达,流行病学发现在糖尿病患者的血浆中,AGE-LDL的水平升高和动脉粥样硬化及冠心病的发生具有正相关。目前发现AGE-LDL通过RAGE及CD36受体结合,激活胞内p38/MAPK以及NF-KB等细胞因子-炎症反应转导通路,产生超氧化物并活化NADPH,上调炎症因子的表达和对单核巨噬细胞产生趋化作用。最近Hodgkinson等发现AGE和LDL的结合物(AGE-LDL)可以与人冠状动脉内皮细胞以及人、鼠的巨噬细胞上的TLR4 (Toll-like receptor 4)受体相互作用,活化细胞内的p38αJNK、ERK1激酶和AP1、Elk1、NF-κB等转录因子从而产生细胞因子,进而造成糖尿病患者并发动脉硬化。TLR4属于Toll样受体的一个亚型,Toll样受体是天然免疫系统识别病原微生物的主要受体,属于IL-1家族,其广泛表达于各种组织细胞中,在天然免疫反应中发挥重要的作用。目前发现人类Toll样受体有11个亚型；在上皮细胞、内皮细胞、单核/巨噬细胞,DC细胞以及T、B细胞等多种类型的细胞上均发现有Toll样受体表达。TLR4是细菌脂多糖介导信号跨膜转导的主要受体,对于革兰氏阴性菌的感染性炎症至关重要。目前研究发现,TLR4不仅可以识别LPS和FimH,其他内源性配体如HSP60、HSP70以及胞外基质的降解产物如透明质烷、硫酸乙酰肝素、纤维结合蛋白EDA区域、纤维蛋白素原、蛋白多糖以及HMGB1、Tamm-Hosfall糖蛋白、肺表面活性物质A、修饰的LDL等也可以直接和TLR4相互作用引起胞内信号转导,产生生物学效应。目前已知TLR4引起的胞内信号转导包括MyD88依赖性途径和非依赖性途径。MyD88依赖性途径主要引起NF-κB活化、细胞因子的产生,而MyD88非依赖性途径主要负责LPS诱导的INF表达和树突状细胞成熟。在肾小管上皮细胞上和系膜细胞上表达有TLR1、2、3、4和6。临床和实验都已证实,Toll样受体参与了急性肾损伤(AKI)、肾脏免疫排斥以及免疫性肾小球肾炎等多种肾脏疾病的发生和发展。这些疾病的病因以及病理生理各不尽相同,但是在开始时都伴随有Toll样受体的活化,引起胞内信号通路转导,产生炎症因子和化学因子,导致组织炎症和纤维化。对于肥胖、糖尿病以及慢性肾衰竭的患者,有全身广泛的微炎症和氧化应激状态,同时血浆中的AGE-LDL也明显上升,患者的肾小管上皮细胞的逐步萎缩坏死,同时肾小管间质也逐渐纤维化。所以我们高度猜测AGE-LDL可能作为免疫介质,通过先天性免疫受体TLR4对肾小管产生损伤作用。本实验主要目的是探寻AGE-LDL是否通过肾小管上皮细胞的TLR4受体及其信号通路,引起肾小管及间质炎症和纤维化；通过体外培养人肾小管上皮细胞(HK-2)细胞,探寻AGE-LDL引起肾小管间质炎症及纤维化是否通过TLR4受体及Toll信号通路；明确AGE-LDL在肾脏小管炎症和纤维化过程中的致病机理；在氧化应激与天然免疫之间建立起新的联系。研究方法一.无内毒素糖基化修饰的白蛋白(脂蛋白)制备与鉴定1.无内毒素AGE-HSA的制备与鉴定按文献方法体外制备无内毒素AGE-HSA修饰蛋白。将1.75g/L纯化的HSA分别置于含或不含0.1mol/L D-葡萄糖的0.4M磷酸盐缓冲液中,37℃孵育8周；用pH7.4磷酸盐缓冲液透析以除去葡萄糖。以在同样条件下不含葡萄糖的缓冲液中孵育8周的HSA作为对照,用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌消毒后,制备的样本经荧光分光光度分析法鉴定,4℃无菌保存。所有制备AGE-HSA和未经修饰的HSA经鲎试验法检测内毒素含量均低于0.25EU/ml。2.无内毒素AGE-LDL的制备与鉴定根据文献方法,将购买的LDL(2 mg protein/ml)和0.2M D(+)-glucose,以及抗氧化剂(1mg/ml EDTA和10μM BHT)混合均匀,无菌的氮气条件下,37℃孵育4周。制备出AGE-LDL在4℃,pH7.4无内毒素的PBS中透析24小时,用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后4℃保存。制备的AGE-LDL与LDL比较(以LDL为标准)。使用trinitrobenzene sulphonic acid assay (TNBS法)检测游离蛋白含量(AGE-LDL 0.72±0.032AU VS. LDL 1.00±0.001AU, P<0.05); Spectrofluorimetry(荧光分光光度计法)检测生成的AGE含量(excitation/emission 335/385nm) (AGE-LDL 6.34±0.56 VS. LDL 1.00±0.49, P<0.05); thiobarbituric acid-reactive substance (TBARS)法检测(AGE-LDL 1.23±0.32 VS. LDL 1.00±0.032, P>0.05);琼脂糖凝胶电泳迁移率实验(AGE-LDL 1.18±0.32 VS. LDL 1.00±0.000, P>0.05);以上实验表明AGE-LDL制备成功。所有制备AGE-LDL和未经修饰的LDL经鲎试验法检测内毒素含量均低于0.25EU/ml。二.人肾小管上皮细胞(HK-2细胞系)的培养人近端肾小管上皮细胞系(HK-2细胞系)细胞购自美国ATCC库。细胞复苏后在37℃,5%CO2的条件下,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养细胞,待细胞长至70%-80%时,改用无血清培养基静置细胞16-24小时后用于实验。本研究使用6-10代细胞进行实验。倒置显微镜下观察细胞形态为铺路石样。三.人肾小管上皮细胞系TLR-4受体的检测和定位1.流式细胞仪检测肾小管上皮细胞上细胞膜TLR4受体收集处于对数生长期的HK-2细胞,固定后封闭后,加入兔抗人TLR4一抗过夜,用非免疫羊IgG作阴性对照,FITC荧光标记的兔抗山羊二抗避光孵育,PBS重悬细胞后,流式细胞仪检测。2.免疫荧光检测肾小管上皮细胞上细胞膜TLR4受体人近端肾小管细胞上皮(HK-2细胞)培养于置有盖玻片的培养板上,待细胞生长至约70%融合,固定封闭后,加入兔抗人TLR4一抗过夜,用非免疫羊IgG作阴性对照,FITC荧光标记的兔抗山羊二抗避光孵育,碘化丙啶(PI)室温避光孵育染核,缓冲甘油封片。在荧光显微镜下观察、拍片。四.AGE-LDL等诱导人肾小管上皮细胞表达IL-6和IFN-β人近端肾小管细胞上皮(HK-2细胞)分别加入LDL(100μg/ml). HSA(100μg/ml).AGE-LDL(100μg/ml)和AGE-HSA(200μg/ml)刺激6小时,提取mRNA,qRT-PCR检测IL-6和IFN-β。或者刺激12小时,集细胞上清,按试剂盒说明,ELISA法检测IL-6在细胞上清中的浓度。五.AGE-LDL诱导人肾小管上皮细胞表达IL-6的时间、浓度效应人肾小管细胞上皮(HK-2细胞)分别加入25、50、100μg/mlAGE-LDL或100μg/ml未经修饰的LDL,于0、3、6、12及24小时收集细胞提取总RNA,行qRT-PCR检测IL-6 mRNA。或者收集细胞上清,按试剂盒说明,ELISA法检测IL-6在细胞上清中的浓度,并以细胞总蛋白量矫正。人肾小管细胞上皮(HK-2细胞)分别加入或不加入10μg/ml多粘菌素B(PMX-B),孵育2小时候加入100μg/ml AGE-LDL或10gg/ml LPS,6小时后收集细胞提取总RNA,行qRT-PCR检测IL-6 mRNA。六.TLR4介导AGE-LDL诱导人肾小管上皮细胞表达IL-61.TLR4 siRNA干扰后,AGE-LDL诱导人肾小管上皮细胞表达IL-6的变化肾小管细胞上皮(HK-2细胞)使用TLR4 siRNA 100pmol有效干扰后,分别加入LDL(100μg/ml)、AGE-HSA(200μg/ml)和AGE-LDL(100μg/ml),6小时后收集细胞,提取总RNA,行RT-PCR检测。2.TLR4中和抗体阻断后,AGE-LDL诱导人肾小管上皮细胞表达IL-6的变化人肾小管细胞上皮(HK-2细胞)分别加入5μg/ml.1 Oμg/ml.20μg/ml兔抗人TLR4抗体或20μg/ml同源非免疫的兔IgG抗体,预孵2小时后,分别加入100μg/mlAGE-LDL,6小时后收集细胞,提取总RNA,行RT-PCR检测。3.阻断或中和TLR4受体,可以减少AGE-LDL诱导的HK-2细胞分泌IL-6人肾小管细胞上皮(HK-2细胞)分别和TLR4中和抗体20μg/ml预孵2小时或者使用TLR4 SiRNA 100pmol干扰48小时后,加入AGE-LDL 100μg/m1孵育12小时,ELISA检测细胞上清中的IL-6蛋白的水平,并以蛋白浓度校正。4. AGE-LDL对人肾小管上皮细胞TLR4表达的影响人肾小管细胞上皮(HK-2细胞)分别加入100μg/ml AGE-LDL于0、1、3、6、12及24小时收集细胞。Western-blot检测TLR4蛋白表达情况。七.AGE-LDL对人肾小管上皮细胞TLR4和下游Myd88/TRIF蛋白的影响1. AGE-LDL对人肾小管上皮细胞Myd88和TRIF表达的影响人肾小管细胞上皮(HK-2细胞)分别加入100μg/ml AGE-LDL于0、5min、15min、30min、1h、3h及6小时收集细胞。Western-blot检测Myd88和TRIF蛋白表达情况。2. Myd88/TRIF siRNA干扰后,AGE-LDL诱导人肾小管上皮细胞IL-6 mRNA肾小管细胞上皮(HK-2细胞)使用Myd88/TRIF siRNA 100pmol有效干扰后,分别加入100μg/ml AGE-LDL或10μtg/ml LPS,6小时后收集细胞,提取总RNA,行RT-PCR检测。3.阻断TLR4后,AGE-LDL对人肾小管上皮细胞Myd88和TRIF表达的影响肾小管细胞上皮(HK-2细胞)使用TLR4 siRNA 100pmol有效干扰后或者是20μmol/L鼠抗人TLR4抗体预孵2小时后,分别加入100μg/ml AGE-LDL刺激6h后收集细胞,Western-blot检测Myd88和TRIF蛋白表达情况。八.AGE-LDL对人肾小管上皮细胞MAPK的影响1. AGE-LDL对人肾小管上皮细胞MAPK表达的影响人肾小管细胞上皮(HK-2细胞)分别加入100μg/ml AGE-LDL和10μg/ml LPS于0、5min、15min、30min及1小时收集细胞。Western-blot检测MAPK激酶(p38、JNK、ERK)和磷酸化MAPK激酶(p-p38、p-JNK、p-ERK)的蛋白表达情况。2.抑制MAPK后,AGE-LDL诱导人肾小管上皮细胞IL-6 mRNA的变化人小管细胞上皮(HK-2细胞)DMSO、PD98059、SB203580 (p38)、SP420119 (JNK). UO126(ERK)各10μmol/ml预孵2小时后,用AGE-LDL(100μg/ml)刺激6小时,收集细胞,提取总RNA,行RT-PCR检测IL-6 mRNA。3.阻断TLR4后,AGE-LDL对人肾小管上皮细胞MAPK表达的影响肾小管细胞上皮(HK-2细胞)使用TLR4 siRNA 100pmol有效干扰后或者是20μmol/L鼠抗人TLR4抗体预孵2小时后,分别加入100μg/ml AGE-LDL刺激15min后收集细胞。Western-blot检测MAPK激酶(p38、JNK、ERK)和磷酸化MAPK激酶(p-p38、p-JNK、p-ERK)的蛋白表达情况。九.AGE-LDL对人肾小管上皮细胞NF-KB的影响1. AGE-LDL对人肾小管上皮细胞NF-KB/p65表达的影响人肾小管细胞上皮(HK-2细胞)分别加入100μg/ml AGE-LDL和10μtg/ml LPS于0、5min、15min、30min、1h、3h及6小时收集细胞。Western-blot检测NF-κB/p65和磷酸化NF-κB(p-p65)的蛋白表达情况。2. AGE-LDL对人肾小管上皮细胞NF-KB/p65的核转移人肾小管细胞上皮(HK-2细胞)培养于置有盖玻片的6孔细胞培养板上分别加入100μg/ml AGE-LDL或10μg/ml LPS刺激0、15min和30min。固定,封闭后,加入抗人NF-κB/p65抗体一抗过夜,用非免疫兔IgG作阴性对照,Alex488荧光标记的羊抗兔二抗避光孵育45分钟,Hochest 33258染核,树脂封片。在共聚焦显微镜下观察、拍片。3.阻断TLR4后,AGE-LDL对人肾小管上皮细胞NF-κB表达的影响肾小管细胞上皮(HK-2细胞)使用TLR4 siRNA 100pmol有效干扰后或者是20μtmol/L鼠抗人TLR4抗体预孵2小时后,分别加入100μg/ml AGE-LDL刺激15min后收集细胞。Western-blot检测NF-κB/p65和磷酸化NF-κB(p-p65)的蛋白表达情况。4. Myd88/TRIF siRNA干扰后,AGE-LDL对小管上皮细胞NF-KB表达的影响肾小管细胞上皮(HK-2细胞)使用Myd88/TRIF siRNA 100pmol有效干扰后,分别加入100μg/ml AGE-LDL或10μg/ml LPS刺激15min后收集细胞。Western-blot检测NF-KB/p65和磷酸化NF-κB(p-p65)的蛋白表达情况。5.阻断NF-κB干扰后,AGE-LDL诱导人肾小管上皮细胞IL-6 mRNA的变化肾小管细胞上皮(HK-2细胞)使用NF-KB/p65 siRNA 100pmol有效干扰后或者是10(imol/L NF-κB/p65抑制剂Bay11-7082预孵2小时后,分别加入100μtg/mlAGE-LDL刺激6h后收集细胞,提取总RNA,行RT-PCR检测IL-6 mRNA。十.CD36参与AGE-LDL诱导人肾小管上皮细胞表达IL-6肾小管细胞上皮(HK-2细胞)使用CD36 siRNA 100pmol有效干扰后,或者是20μmol/L鼠抗人CD36抗体预孵2小时后,分别加入100μg/ml AGE-LDL刺激6小时后收集细胞,提取总RNA,行RT-PCR检测。十一.统计学方法所有数据均代表3次重复实验的结果,以X±S表示。多个样本均数的比较采用One-Way ANOVA,两两比较采用LSD和SNK。实验中不同时间点之间的同一变量比较采用独立样本t检验。所有统计由统计软件SPSS13.0完成,P<0.05为差异有统计学意义。结果一. AGE-LDL等糖基化蛋白(脂蛋白)促进HK-2细胞产生IL-61.1 AGE-LDL等糖基化蛋白(脂蛋白)促进HK-2细胞产生IL-6AGE-LDL、AGE-HSA、LPS等可以上调肾小管上皮细胞(HK-2)IL-6 mRNA的表达(F=140.663,P=0.000)并且刺激HK-2细胞分泌IL-6,HSA的不能上调HK-2细胞表达IL-6 mRNA(P=0.691)也不能刺激HK-2细胞分泌IL-6, AGE-LDL相对于LDL作用是有增强的(P=0.000)。AGE-LDL (P=0.945)、AGE-HSA(P=0.997)等不能上调HK-2细胞表达IFN-p mRNA,LPS可以上调肾小管上皮细胞(HK-2) IFN-βmRNA的表达(F=140.663,P=0.000)。1.2 AGE-LDL诱导HK-2细胞表达IL-6的作用方式AGE-LDL以剂量依赖的方式上调肾小管上皮细胞(HK-2细胞)IL-6 mRNA的表达(F=86.230,P=0.000)以及HK-2细胞的分泌,随着AGE-LDL浓度的增高,IL-6的mRNA表达以及分泌逐渐增加,在位100μg/ml时作用最大；同时AGE-LDL以时间依赖的方式上调HK-2细胞IL-6的mRNA表达以及分泌(F=78.335,P=0.000),刺激6小时后IL-6 mRNA表达最高,刺激12小时后IL-6的分泌最高。1.3 PMX-B不能抑制(?)AGE-LDL的诱导HK-2细胞表达IL-6PMX-B可以抑制LPS诱导HK-2细胞表达IL-6(P=0.000),但是对于AGE-LDL诱导的HK-2细胞表达IL-6没有影响(F=86.230,P=0.967)。二.人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)细胞膜TLR4受体的鉴定2.1 FCM检测人肾小管上皮细胞(HK2细胞)上TLR4受体表达水平流式细胞仪检测TLR4受体,HK-2细胞标记率为13.36±1.80%,而同型对照非免疫山羊IgG一抗,其细胞标记率仅为0.92±0.075%,正常未加抗体的细胞标记率为0.013+0.006%(F=154.165,P=0.000)。2.2免疫荧光检测人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)上TLR4表达免疫荧光检测显示TLR4蛋白在HK-2细胞胞浆和细胞膜周围分布。三.TLR4受体介导AGE-LDL刺激人肾小管上皮细胞产生IL-63.1 TLR4 siRNA抑制HK-2细胞表达TLR4受体TLR4 siRNA可以有效的降低HK-2细胞表达TLR4蛋白,降低TLR4受体的表达达到70%左右(F=90.312,P=0.000)。3.2 TLR4 siRNA干扰后抑制(?)AGE-LDL促进的HK-2细胞产生IL-6TLR4 SiRNA干扰HK-2细胞后,可以有效的降低AGE-LDL诱导HK-2产生IL-6mRNA水平(F=57.380,P=0.000)；相反对于LDL和AGE-BSA诱导的HK-2产生IL-6没有明显的影响(P>0.05)。3.3 TLR4中和抗体抑制(?)AGE-LDL促进的HK-2细胞产生IL-6 mRNA使用鼠抗人TLR4中和抗体,可以抑制(?)AGE-LDL促进的HK-2细胞产生IL-6mRNA (F= 142.096, P=0.000)。结果示10μg/ml和20μg/ml抗体预孵细胞后,可以有效的降低AGE-LDL诱导HK-2产生IL-6 mRNA水平。3.4阻断或中和TLR4受体,可以减少AGE-LDL促进的HK-2细胞分泌IL-6使用鼠抗人TLR4中和抗体或siRNA干扰TLR4表达,可以抑制AGE-LDL促进的HK-2细胞产生IL-6蛋白分泌(F=165.849,P=0.000)3.5 AGE-LDL对人肾小管上皮细胞TLR4表达的影响本实验结果显示,AGE-LDL 100μg/ml对人肾小管上皮细胞的TLR4蛋白表达上没有影响(F=0.543,P=0.740)四.Myd88/TRIF在AGE-LDL刺激HK-2细胞产生IL-6中的作用4.1 AGE-LDL对HK-2细胞Myd88和TRIF表达的影响本实验结果显示,AGE-LDL 100μg/ml对人肾小管上皮细胞的Myd88和TRIF蛋白表达没有影响(F=0.122,P=0.992)4.2 Myd88和TRIF SiRNA分别抑制HK-2细胞表达Myd88和TRIF使用上海吉泰生物科技公司的合成的人Myd88和TRIF siRNA,可以有效抑制HK-2细胞表达Myd88和TRIF SiRNA蛋白。4.3 Myd88和TRIF SiRNA干扰后抑制(?)AGE-LDL促进的HK-2细胞产生IL-6Myd88 siRNA干扰HK-2细胞后,可以有效的降低AGE-LDL和LPS诱导的HK-2所产生的IL-6 mRNA水平升高(F=l 10.374, P=0.000); TRIF siRNA干扰HK-2细胞后,对于AGE-LDL诱导的HK-2说产生IL-6 mRNA的没有明显的影响(P>0.05),而可以有效的降低LPS诱导的HK-2所产生的IL-6 mRNA水平升高(P<0.05)。4.4阻断TLR4受体后,对AGE-LDL对HK-2细胞Myd88和TRIF表达的影响使用鼠抗人TLR4中和抗体或siRNA干扰TLR4表达,各组之间的Myd88和TRIF蛋白表达没有差异。五.MAPK在AGE-LDL刺激HK-2细胞产生IL-6中的作用5.1 AGE-LDL对HK-2细胞MAPK各亚型磷酸化的影响AGE-LDL 100μg/ml在5min时间点可以明显引起p38/MAPK的磷酸化,在15min时间达到高峰,30mmin后开始减弱,并且在1h时间点回复正常(F=1247.671,P=0.000)；在5min时间点可以明显引起JNK/MAPK的磷酸化,在15min后基本回复正常(F=347.289,P=0.000)；没有引起ERK/MAPK的磷酸化(F=0.487,P=0.746)。LPS 10μg/ml在5min时间点可以明显引起p38/MAPK的磷酸化,而15min后开始下降,30min时基本上回复正常(F=294.766,P=0.000)；在5min时间点可以明显引起JNK/MAPK的磷酸化,30min时开始下降(F=314.149,P=0.000),1h后基本上回复正常；在5min时可以明显引起ERK/MAPK的磷酸化,在15min达到高峰(F=374.210,P=0.000)。5.2抑制MAPK激酶后,AGE-LDL诱导的HK-2细胞产生IL-6的变化总的MAPK抑制剂PD98059、和p38抑制剂SB203580以及JNK抑制剂SP420119均能降低AGE-LDL引起的IL-6 mRNA的上升,其中以PD98059作用最强,JNK抑制剂SP420119作用最弱(F=145.680,P=0.000),而ERK抑制剂U0126不能减少IL-6 mRNA的表达(P>0.05)5.3阻断TLR4受体后,对AGE-LDL引起的HK-2细胞MAPK亚基磷酸化的影响使用鼠抗人TLR4中和抗体或siRNA干扰TLR4表达后,可以降低AGE-LDL1001μg/ml在15min引起的HK-2细胞p38/MAPK(F=218.083,P=0.000)和JNK/MAPK磷酸化(F=67.954,P=0.000)六.NF-κB在AGE-LDL刺激HK-2细胞产生IL-6中的作用6.1 AGE-LDL对HK-2细胞NF-κB/p65亚基磷酸化的影响AGE-LDL可以引起HK-2细胞的NF-KB/p65磷酸化(F=618.115,P=0.000)。在5min时间点可以明显引起NF--B/p65的磷酸化,在15mmin时间达到高峰,30min后开始减弱,并且在3h时间点回复正常。6.2 AGE-LDL诱导NF-κB/p65在HK-2细胞中核转移100μg/ml AGE-LDL可以刺激人肾小管细胞上皮(HK-2细胞)的NF-KB/p65磷酸化并且转移入核。6.3阻断TLR4受体,对AGE-LDL引起的HK-2细胞NF-κB/p65亚基磷酸化的影响使用鼠抗人TLR4中和抗体或siRNA干扰TLR4表达后,可以降低AGE-LDL100μg/ml在15mmin引起的HK-2细胞p65蛋白的磷酸化(F=57.983,P=0.000)。6.4阻断Myd88/TRIF,对AGE-LDL引起的HK-2细胞NF-κB/p65亚基磷酸化的影响使用siRNA分别干扰Myd88和TRIF蛋白的表达后,可以降低AGE-LDL100μg/ml在15min引起的HK-2细胞NF-KB/p65蛋白的磷酸化(F=100.125,P=0.000)；Myd88 siRNA和’TRF SiRNA有效干扰后,也可以降低10μg/ml LPS刺激HK-2细胞引起的p65的磷酸化。6.5阻断NF-κB,AGE-LDL诱导的HK-2细胞产生IL-6的变化使用NF-KB/p65-siRNA干扰HK-2细胞p65表达或者NF-KB IKB磷酸化抑制剂Bay11-7082预孵HK-2细胞后,可以有效的降低AGE-LDL诱导的HK-2所产生的IL-6 mRNA水平升高(F=129.390,P=0.000)七.阻断CD36后,抑制AGE-LDL引起的HK-2细胞IL-6的表达CD36 siRNA干扰或使用阻断抗体,均可以有效的抑制(?)AGE-LDL诱导HK-2产生IL-6(F=159.943,P=0.000)结论一.AGE-LDL以时间和剂量依赖的方式上调人肾小管上皮细胞IL-6表达。二.AGE-LDL通过人肾小管上皮细胞膜TLR4受体上调IL-6表达。三.AGE-LDL主要通过Myd88上调人肾小管上皮细胞IL-6表达。四.AGE-LDL可以活化MAPK的p38和JNK亚基和NF-KB的p65亚基,是通过TLR4和Myd88介导,并且通过TLR4—Myd88—MAPK(p38/JNK)/NF-κB上调人肾小管上皮细胞IL-6表达。