内质网作为内膜系统的核心，具有参与蛋白质合成、转运，糖原分解和脂类、胆固醇合成等功能。肝脏中，内质网还参与内源的疏水代谢产物和异源物质的生物转化。内质网功能的失调能引起细胞的功能异常和一系列疾病。为了深入了解内质网在肝脏中所发挥的重要功能，我们对C57BL/6J小鼠和成人健康肝脏内质网蛋白质组进行了研究。作为人类肝脏蛋白质组计划(Human liver proteome project, HLPP)一部分，本研究采用了联合提取细胞器的策略，可以同时从同一个肝脏匀浆液中获得内质网、胞浆、线粒体、细胞膜和细胞核多种细胞器样本。联合提取细胞器的技术策略一方面可以充分利用样品，尤其是难以获得的临床样本；另一方面可以有利于将来对来自同一匀浆液的各个亚细胞组分进行系统比较。样品的准备是组织来源的亚细胞组分分离的关键，本文首次对新鲜样本、冻存液冻存样本和直接冻存样本提取的细胞器进行了比较，提出了一种备选的除新鲜组织之外的样品准备方案，即冻存的肝匀浆液方式，该方法尤其适合于不方便新鲜获得的临床样本及满足样本建库的需求。另外，我们通过综合评价提出，直接冻存的肝脏组织所提取细胞器不适合用于表达谱研究。在获得了高度富集内质网组分的基础上，我们分别构建了C57BL/6J小鼠和成人健康肝脏内质网的蛋白质表达谱。由于肝脏样本的复杂性和内质网自身组成的多样性，我们有必要选择一种适合分离复杂样本的高通量蛋白质鉴定技术路线。SDS-PAGE结合nano-LC-ESI-MS/MS技术策略，是一种被广泛采用的通量化蛋白质组技术路线。本研究在选用该技术策略基础上，同时引入了质谱分段扫描的分离模式(Gas phase fractionation，GPF)，该模式根据m/z比在肽段水平上对其进行第三维的分离。结果表明，分段扫描的引入分别从肽段和蛋白质水平上增加了50％的鉴定率，从而有效扩展了内质网蛋白质组。另外对分段扫描所捕捉到的电荷性质进行分析，发现980-1600波段能够有效地捕捉到容易在全波段扫描丢失掉的单电荷肽段。在高通量的3-D蛋白质鉴定技术路线基础上，采用反库评价方法对蛋白质可信度进行评估，在大于95％置信度、双肽段以上匹配的高可信度卡值的标准下，分别有1065、921种蛋白质在小鼠肝脏滑面、粗面内质网中得到鉴定；1254和920种蛋白质在成人肝脏滑面和粗面内质网中得到鉴定。采用本实验室根据Gene Ontology(http://www.ebi.ae.uk/ego/)开发的软件GOfact工具对小鼠肝脏内质网蛋白质表达谱数据进行功能注释，结果显示除内质网所特定的功能模块得到了显著富集外，我们很意外的发现滑面内质网相对富集了钙结合蛋白质。将我们的数据与文献报道的内质网蛋白质组(大鼠分泌途径蛋白质组，1237个蛋白质)进行比较，两者共有662个蛋白质，分别占自身和大鼠数据的53.5％和42.5％。我们推测这部分共有的蛋白质可能是组成型表达蛋白质，对维持内质网的基本生理学功能发挥重要作用。Gene Ontology超几何分析证明了这个推测。分别将两者共有和特有的蛋白质进行进行GOfact超几何分布分析，结果表明结构分析活性和维持细胞稳态的蛋白质在共有蛋白质中显著富集；而应激反应(压力应激、生命物刺激应激和免疫应激)和基因表达调控功能模块在特有蛋白质中富集。提示共有蛋白质相对富集了一些恒定表达的结构蛋白质，而特有蛋白质则相对富集了一些调控型表达的蛋白质或穿梭蛋白质。根据串联质谱的谱图数对鉴定蛋白质进行半定量，已经成为目前广泛采用的蛋白质定量方法之一，在此我们采用了一种基于期望值最大化(EM)校正过质谱谱图计数的方法对所鉴定的蛋白质进行量化。然后采用spearman相关的方法对其分别在粗面、滑面和胞浆中的定量分布进行聚类。结果分别发现了一批与粗面、滑面和胞浆标志性蛋白共聚类的蛋白质，根据Swiss-Prot的定位注释分析，除部分已知定位于该细胞器的蛋白质，还有大量的未知定位信息的蛋白质分布其中，包括217个数据库中提示仅在转录水平检测到的新蛋白质。同时我们还意外的发现了4个与已知定位认识不相符的蛋白质，分别是Nmi、Ifi35、Cdk5和Drgl，我们的数据显示，该类蛋白质在共聚类分析中以高可信度定位于内质网(相关系数大于0.95，p＜0.05)中，而据数据库和文献报道这些蛋白质定位于胞浆中。我们采用了荧光共定位的方法，首批验证了Ifi35在内质网中的定位。本研究作为HLPP计划中的一部分，首先对样本保存方式及细胞器提取策略进行了系统的比较和评价，在此基础上所形成的冻存肝脏匀浆液备选保存方法和细胞器联合提取技术方案已成为中国人类肝脏蛋白质计划中亚细胞蛋白质表达谱构建的标准操作规范(Standard operation procedure，SOP)。采用引入气相分段扫描的三维(3-D)蛋白质鉴定技术策略和高于国际通用的数据卡值标准(大于95％置信度、双肽段以上匹配)，我们分别从6，152、6，935个非冗余肽段中获得了921和1065个高信度蛋白质。通过对这些蛋白质的定量和聚类分析，发现了217可能定位于内质网上的未知功能蛋白质和4个与已知定位认识矛盾的蛋白质，采用荧光共定位方法首批确证了Ifi35的内质网上定位。