论文部分内容阅读
由植物病原真菌禾顶囊壳小麦变种(Gaeumannomyces graminis var.tritici,Ggt)引起的小麦全蚀病传播速度快,破坏性强,已在各地小麦产区造成严重减产。生物防治安全环保,具有广阔应用前景。本项研究以实验室前期筛选获得对小麦全蚀病有显著防治效果的芽孢杆菌Z-14菌株为基础,研究其对小麦根际土壤微生态的影响,鉴定其产生脂肽抗生素的类型及对小麦全蚀病菌的作用机制,通过测定Z-14菌株的基因组分析其次生代谢产物基因簇,探究该菌株基因水平的防病机制,为其后期在防治小麦全蚀病的应用中奠定基础。本研究测定了 Z-14菌株对小麦根际土壤养分、pH、微生物数量和酶活力的影响,结果表明,在小麦生长24 d时,接种3次Z-14菌株的处理组对比病原菌对照组,其速效氮磷钾含量分别增加了 21.00 mg/kg、2.71 mg/kg、13.34mg/kg;土壤中细菌和放线菌数量分别增加1.90×108 cfu/g和6.40×106 cfu/g,真菌数量降低了 4.60×103 cfu/g;碱性磷酸酶和纤维素酶活性分别增加6.00%和18.69%,对脲酶和过氧化氢酶活性影响不显著。为了研究Z-14菌株对土壤微生物碳代谢能力的影响,采用Biolog-Eco板检测各处理组土壤样品碳代谢的变化。接种1次Z-14菌株和接种3次Z-14菌株的处理组土壤微生物代谢活性AWCD值和微生物群落的优势度Simpson丰富度、Shannon-Winener以及均匀度Pielou index显著高于空白对照组和病原菌对照组,且接种3次Z-14菌株的处理组高于接种1次的处理组。主成分分析结果表明,对第一和第二主成分贡献较大的碳源主要有糖类、氨基酸、羧酸和聚合物。此外,接种3次Z-14菌株后的小麦根际土壤中微生物群落对碳源中糖类、氨基酸、羧酸和聚合物的利用能力显著增强。采用高通量测序检测了 Z-14菌株对土壤微生物多样性的影响。土壤样品的稀释性曲线和Shannon曲线表明此次试验结果准确可靠。通过Alpha多样性分析,土壤样品的细菌和真菌群落丰富度指数和多样性指数(Chao1、Ace、Shannon、Simpson)均表明测序结果可代表样本中微生物的真实情况。与未作处理的空白对照组相比,接种3次Z-14菌株后土壤中被孢霉属(Mortierella)、赤霉菌属(Gibberella)、曲霉属(Aspergillus)、属毛壳菌属(Chaetomium)的相对丰度分别增加了 3.25%、0.84%、2.19%、0.50%,盘菌属(Peziza)相对丰度显著降低了 17.87%;接种1次和3次生防芽孢杆Z-14的处理组土壤中的芽孢杆菌属(Bacillus)相对丰度分别增加了 1.08%、2.21%。Z-14菌株增加了土壤中真菌和细菌的Alpha多样性指数、物种丰富度和多样性。利用基质辅助激光解吸飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF-MS)和串联质谱(MS/MS)鉴定Z-14菌株发酵上清液中的脂肽抗生素为C14~C16 fengycin A、C15~C17 fengycin B和C14~C15 iturin A。荧光显微镜、扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察结果表明,fengycin和iturin A均可通过使细胞壁疏松或消失、细胞膜变形退化,细胞器消解,细胞质固缩等使菌丝干瘪、蜷缩、甚至断裂,从而抑制Ggt的生长,导致细胞凋亡。Fengycin主要通过破坏细胞器和消解细胞质抑制Ggt生长,而iturin A则通过破坏Ggt的细胞壁和细胞壁使菌丝断裂达到抑制病原菌生长的目的。为了研究Z-14菌株在基因水平上的防病机制,结合第二代Illumina平台和第三代PacBio平台的测序技术对Z-14菌株进行全基因组测序,分析其对病原菌的拮抗机制以及发掘其生物防治功能的潜力。结果表明,Z-14菌株基因组大小为4 135 736 bp,共编码基因4 233个,将其基因组数据与GO、COG、KEGG等数据库进行比对分析,完成基因组功能注释,基于16S rDNA及gyrA基因序列构建系统发育树,鉴定Z-14菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。通过对Z-14菌株生防特性相关基因的分析,发现Z-14菌株的基因组中分别包括运动与趋化性相关基因、生物膜形成相关基因、多糖降解相关基因和促植物生长相关基因各53、40、13和7个;预测到菌株Z-14的次生代谢产物基因簇共有10个,其中6个与已知相似度达100%的抗生素合成基因簇(Macrolactin H、Bacillaene、Fengycin、Difficidin、Bacillibactin、Bacilysin)、1 个与已知相似度达91%的抗生素合成基因簇(Surfactin)、1个与已知相似度仅达22%的抗生素合成基因簇(Rhizocticin)和2个未知功能的基因簇。解淀粉芽孢杆菌Z-14菌株具有较强的拮抗植物病原菌的潜力及广阔的农业应用前景。