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第一部分TNAP与心肌梗死后心肌纤维化的相关性研究目的:研究组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)与心肌梗死(MI)后心肌纤维化的关系。方法:(1)收集46例急性MI患者为研究组,同期41例冠脉造影检查阴性患者为对照组,TNAP试剂盒测定血清TNAP活性,酶联免疫法测定血清Ⅰ型前胶原羧基端肽(PICP)和Ⅲ型前胶原氨基端肽(PⅢNP)的含量。(2)收集5例陈旧性MI患者心肌样本,天狼星红染色检测心脏纤维化水平,免疫组化方法检测TNAP表达情况。(3)10只8周龄C57BL/6J雄性小鼠随机分为假手术组(sham)和心肌梗死组(MI),每组5只,MI术后两周取心脏标本,Masson染色检测其胶原面积,免疫组化方法检测TNAP表达情况。结果:(1)对照组患者血清TNAP浓度为67.22(67.22±12.83)U/L,TNAP活性为6.20(6.20±2.95)金氏单位/100 ml;MI组患者血清TNAP浓度82.59(82.59±19.25)U/L,TNAP活性8.49(8.49±3.30)金氏单位/100 ml,与对照组相比,MI组患者血清TNAP浓度和活性均显著增加(P<0.01)。(2)MI组患者血清PICP浓度为63.86(42.07-87.68)mg/L,对照组为31.75(26.41-46.49)mg/L;MI组患者血清PⅢNP浓度为1.75(1.35-2.27)mg/L,对照组为1.37(1.13-1.72)mg/L。与对照组相比,MI组患者血清PⅠCP和PⅢNP浓度均显著增加(P<0.01)。(3)血清TNAP活性与PⅠCP和PⅢNP水平呈正相关(r=0.38,P<0.01,r=0.40,P<0.01)。(4)与MI患者心肌梗死远端相比,梗死边界区胶原沉积和TNAP表达均显著上调(P<0.01)。(5)与sham组相比,MI组小鼠心脏组织胶原沉积显著增多(P<0.01),TNAP表达增加(P<0.01),且TNAP的表达与纤维分布区域一致。结论:TNAP参与心肌梗死后心肌纤维化。第二部分过表达TNAP对小鼠心肌梗死后心肌纤维化的影响目的:研究组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)过表达对小鼠心肌梗死(MI)后心肌纤维化(MF)的影响。方法:(1)采用直接心肌注射法在小鼠心室肌多点注射腺病毒Adv-TNAP,转染不同时间(1、3、5、7、14、21)d后,RT-PCR检测TNAP转录(m RNA)水平,Western blotting检测其蛋白表达水平。(2)45只8周龄雄性小鼠随机分为对照组(sham),心肌梗死组(MI+Adv-EGFP)和TNAP过表达组(MI+Adv-TNAP),每组15只。术后2周,使用心脏彩超测定小鼠心脏功能,HE染色观察小鼠心脏组织病理变化,Masson染色检测小鼠心脏纤维化面积,免疫组化检测TNAP表达情况。苦味酸天狼星红染色偏振光法测定各组标本胶原容积分数(CVF)和ColⅠ/Col Ⅲ比例。(3)Western blotting方法检测TNAP、α-SMA、TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白表达情况。结果:(1)腺病毒转染验证:小鼠心脏组织TNAP mRNA和蛋白表达显著上调,5d达峰,持续3周。(2)心脏彩超:与Sham组LVEF、LVFS、LVIDs以及LVIDd[分别是(81.22±2.54)%、(43.62±2.49)%、(0.17±0.02)mm、(0.30±0.03)mm]相比,MI组小鼠心脏LVEF(63.36±3.29)%、LVFS(34.34±0.82)%显著降低,LVIDs(0.22±0.04)mm,LVIDd(0.35±0.04)mm增加,(P均<0.05)。与MI组相比,过表达TNAP组小鼠心脏LVEF(55.10±4.54)%、LVFS(21.90±3.78)%显著降低(P均<0.05),LVIDs(0.31±0.09)mm增加(P<0.05),两组之间LVIDd(0.38±0.05)mm差异不明显。(3)HE染色:Sham组心肌细胞排列整齐、细胞质丰富均匀、胞核多位于肌纤维中央;MI组中心肌细胞排列紊乱,细胞核大小不甚规则,部分心肌细胞核丢失、梗死区域出现纤维化;过表达TNAP组较MI组心肌纤维断裂,排列紊乱,梗死区域纤维化明显。(4)Masson染色和免疫组化:与sham组相比,MI组小鼠心脏纤维化面积显著增多(P<0.01),TNAP表达增加(P<0.05);与MI组相比,过表达TNAP组小鼠心脏纤维化面积增多(P<0.05),TNAP表达增加(P<0.05),且TNAP的表达与纤维分布区域一致。(5)天狼星红染色:与MI组相比,过表达TNAP组小鼠心脏组织CVF显著增加(P<0.05),同时ColⅠ/Col Ⅲ比例显著增加(P<0.05)。(6)Western blotting和RT-PCR:与MI组相比,过表达TNAP组TNAP mRNA和蛋白表达显著增加(P<0.05)。与对照组相比,MI组α-SMA、TGF-β1、p-Smad2、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白表达均显著增加(P<0.05);与MI组相比,过表达TNAP组α-SMA、TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Collagen Ⅰ蛋白表达均显著增加(P<0.05),过表达TNAP组Collagen Ⅲ蛋白表达水平差异不明显,但过表达TNAP组Col Ⅰ/Col Ⅲ比例显著增加(P<0.05)。结论:TNAP过表达促进小鼠心肌梗死后心肌纤维化。