论文部分内容阅读
中国大陆科学钻探(CCSD)钻孔选址于江苏省东海县毛北镇(东经118°3957"~118°4042",北纬34°2334"~34°2505"),是国际大陆科学计划(ICDP)的一部分,由国际大陆科学钻探与中华人民共和国科学技术部共同资助发起的,钻孔位于世界上最大的超高压变质带大别一苏鲁变质带的东端,其温度梯度约为2512/千米。这一特有的科研钻探项目给我国地质微生物的研究提供了一个很好的平台,探索地下深层生物圈的奥秘不但具有重要的科学意义,更深层次的研究也有可能会创造巨大的经济意义。
本研究利用扫描电镜直接观察S54(2976.01米)、S72(3851.60米)的岩石内表面,发现岩石物性不同,则岩石内表面的类似微生物成分的白色物质也存在着有与无的差别;进一步用X射线能谱分析有白斑的S54样品里面的白斑的成分,发现N、P、S等元素在白斑的位置并没有发生聚集的现象,即利用这种单纯的显微镜检测技术并不能确定岩石内部是否有微生物存在,只是观察到了类似微生物的物质。
在外界微生物污染的处理上引入了与微生物大小相类似的黄绿荧光球(直径约0.5um)技术处理岩石表面。在DNA提取缓冲液中加入过量的poly(A),来置换微量的微生物基因组DNA,该方法相比于常用的细菌DNA提取方法,对G+细菌的提取效率为《精编分子生物学实验技术》上提供的方法的2倍,对于G-细菌的提取效率可以达到90%以上:而且通过这种DNA提取的方法,可以对1000个细菌/g岩石的细菌样品进行细菌多样性分析。
本实验重点对6个样品(S1、S5、S9、S13、S42、S97-1)进行了微生物多样性分析,发现这6个样品的细菌OTU种类从最浅层S1(430.00米)的15个一直降到最底层S97-1(5099,52米)的3个。上层的样品(S1、S9、S13、)中未见占据绝对优势的细菌,但是在下面的S42与S97-1中,与Serratia marcescens KRED(AB061685)相类似的细菌就占据绝对优势了,S5的样品中与Serratiamarcescens KRED(AB061685)相似的菌株也是优势菌,此外在S9与S13的样品中发现了低G+C%的G+细菌。在对所有样品做古菌分析时,只有S9的样品能够得到古菌的16Sr DNA片段,做古菌多样性分析后,发现只有5种不同的古菌,而且S943A还与3200米处的岩浆中的一株细菌存在着较高的同源性,其相似性达到97%。
对27个岩石样品进行DAPI染色记数分析,发现地下生物圈的下限是4851米,即在该位置用此方法已经探测不到微生物,用此方法发现的最大生物量为1.1×108个/g岩石,该样品的位置正处于一个断裂带上。用PLFA对不同深度的9个样品进行数量分析,发现CCSD钻孔的生物圈的下限是4500.32米,最大生物量为1.53×106个/g岩石,样品位置为3352.28米。而用实时定量PCR的方法,分析S13的两个菌株,发现CCSD1305的生物量为6.6×104个/克岩石,CCSD1307的生物量为2.18×106个/克岩石。
在好氧条件下,选择S13、S16、S42三个样品进行常温细菌的培养,分别得到18株、2株和0株细菌,因为其菌落形态都很相似,所以只鉴定了S13的两个细菌CCSDFL1301、CCSDFL1302,发现这两个菌都是短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus),且与未培养分析中的CCSD1315菌株的相似性为99%。对3911.28米的样品进行现场取样,利用甲烷细菌培养基(H2/CO2)现场培养,得到一个菌株CCSDFL3900,鉴定发现该菌为端生芽孢(很难观察到)、不运动,细胞宽0.6—0.8um,长度3—5um;是Geobacillus stearothermophilus中的一株,该菌的最适生长温度为65℃,最适pH为7.0。
本论文通过对CCSD深层的地下微生物研究,为以后的研究工作打下了一定的基础,也为探索新型微生物资源的利用打开了新的篇章。