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目的:心肌梗死（myocardial infarction,MI,以下简称为“心梗”）作为缺血性心脏病最严重的一种类型,是我国城乡居民致残致死的主要原因,常导致心力衰竭、心源性猝死等一系列并发症。心肌细胞凋亡是心梗的一个重要的病理特征,其始于长时间的心肌缺血,是冠脉闭塞导致心肌损伤的主要形式。在心梗后数小时至数天内,梗死区及边缘区均可见凋亡的心肌细胞;此外,细胞坏死也常继发于凋亡,且多发生在凋亡活化的心肌细胞内。在心梗发生后,心肌细胞凋亡是导致左心室病理重构和心力衰竭的重要危险因素,抑制心肌细胞凋亡可有效地控制心梗患者病情恶化,改善其心脏功能。磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B,AKT）信号通路广泛地参与细胞增殖和凋亡等生理过程,该信号通路蛋白可被磷酸化激活,抑制心肌细胞凋亡,发挥心肌保护效应。人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）具有高度的可塑性和分化为其他类型细胞的潜能,既往研究表明HUVECs移植增加了心梗后的冠脉血流灌注,改善不良心室重构。然而,细胞移植疗法存在诸多局限性,例如移植后免疫排斥、细胞存活率低和致瘤性等。外泌体（exosomes,Exo）是细胞通过主动或者被动过程释放的直径30～150 nm的双层脂质囊泡,其携带多种分子货物,在细胞间通讯中扮演重要角色。由于外泌体保留了亲本细胞的功能,且具有低免疫原性,稳定性,易于内化到受体细胞等优点,以外泌体为基础的无细胞疗法成了目前心血管疾病治疗的焦点。本实验的目的是探讨人脐静脉内皮细胞来源外泌体（human umbilical vein endothelial cells-derived exosomes,HUVECs-Exo）对心肌梗死的作用及机制。方法:培养实验所需的HUVECs,收集新鲜的上清液,通过超高速离心法将细胞释放至上清液中的外泌体分离出来,随后储存在液氮中,以备后续实验使用。通过透射电子显微镜观察HUVECs-Exo的形态,纳米颗粒追踪分析检测HUVECs-Exo的颗粒浓度以及大小分布范围,蛋白免疫印迹（western blotting,WB）检测HUVECs-Exo表面的特征性标志蛋白包括肿瘤易感基因101（tumor susceptibility 101,TSG101）、白细胞分化抗原63（cell differentiation antigen 63,CD63）、白细胞分化抗原81（cell differentiation antigen 81,CD81）,以及阴性对照钙联蛋白（Calnexin）的表达。选取8周龄成年C57BL/6雄性小鼠,随机分成三组（n=6 per group）:Sham组、MI+PBS组、MI+Exo组。采用开胸后冠状动脉左前降支结扎手术构建小鼠心梗模型,MI+PBS组和MI+Exo组分别是在小鼠冠脉左前降支结扎后,立即往梗死区域心肌原位注射25 ul无菌磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline,PBS）或HUVECs-Exo（2 ug/ul）,Sham组进行同样的手术过程,但在心脏的相同位置,只穿线不作冠脉左前降支结扎。在术后1天或28天,通过经胸超声心动图评估小鼠的心功能。在术后1天、7天或28天,过量麻醉安乐死小鼠并取材（心脏）。通过心电图和2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyte-trazoliumchloride,TTC）染色,确认小鼠心梗模型是否造模成功;苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色评估各组小鼠的心肌病理变化和炎症浸润情况;末端脱氧核苷酰转移酶介导的原位末端标记法（terminal deoxynucleotidyl transferase d UTP nick-end labeling,TUNEL）染色检测各组小鼠心脏组织切片的心肌细胞凋亡指数;马松（Masson）染色评估各组小鼠的心室胶原沉积情况,心肌纤维化面积以及瘢痕周长。正常培养实验所需的大鼠心肌细胞（H9C2细胞）,将其分为三组（n=6 per group）:常氧（Normoxia）组、缺氧（Hypoxia）+PBS组、Hypoxia+Exo组。低糖改良杜氏伊格尔培养基和无胎牛血清培养H9C2细胞并种在孔板中,分别在Hypoxia+PBS组、Hypoxia+Exo组的培养基中加入PBS或HUVECs-Exo（50 ug/ml,即每1ml培养液加入50 ug HUVECs-Exo）,放置于缺氧培养箱中共孵育24 h。流式细胞术检测H9C2细胞的凋亡率;细胞计数试剂盒（cell counting kit-8,CCK-8）评估H9C2细胞活力,乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）细胞毒性试剂盒检测H9C2细胞的LDH释放。PKH26红色荧光染料对HUVECs-Exo进行染色标记,将H9C2细胞种在孔板上,分别往培养基加入PKH26标记的HUVECs-Exo或阴性对照PBS,在上述同样的环境中共孵育24 h,随后用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对H9C2细胞进行细胞核染色后,置于荧光显微镜下判断H9C2细胞对HUVECs-Exo的摄取能力;提取Sham组、MI+PBS组和MI+Exo组小鼠的心脏组织蛋白,WB检测各组小鼠凋亡相关蛋白:Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein,Bax）、B细胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma-2,Bcl-2）、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3（cleaved caspase-3）的表达水平,以及PI3K/AKT信号通路相关蛋白:PI3K、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase,p-PI3K）、AKT、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B,p-AKT）的表达水平。结果:透射电子显微镜下鉴定HUVECs-Exo的形态为一侧凹陷的半球形结构,纳米颗粒追踪分析显示HUVECs-Exo的粒径分布主要在100～150 nm左右,颗粒浓度为3.39×10~8 particle/ml;WB检测到HUVECs-Exo表面的特征性标志蛋白包括TSG101、CD63、CD81呈高表达,而阴性对照Calnexin几乎未见表达。在小鼠冠脉左前降支结扎后,心电图显示ST段呈弓背向上抬高。在术后1天,TTC染色显示小鼠正常心肌区域呈鲜红色,梗死心肌区域呈苍白色,提示小鼠心梗模型造模成功,且造模总成功率为91%;经胸超声心动图显示相比于Sham组小鼠,MI+PBS组和MI+Exo组小鼠的心功能均下降且无显著性差异。在术后7天,与MI+PBS组小鼠相比,MI+Exo组小鼠的HE染色表明心肌坏死程度和炎症细胞浸润减轻。在术后28天,与MI+PBS组小鼠相比,MI+Exo组小鼠心脏组织的TUNEL染色显示心肌细胞凋亡指数降低;Masson染色显示心肌纤维化面积和瘢痕周长减小,胶原沉积程度更轻;经胸超声心动图提示心功能改善。在缺氧24 h后,相比于Hypoxia+PBS组,Hypoxia+Exo组流式细胞术检测发现H9C2细胞凋亡明显减少;CCK-8检测显示更强的H9C2细胞活力;LDH细胞毒性检测提示H9C2细胞释放的LDH减少。外泌体内吞实验表明HUVECs-Exo可以成功被H9C2细胞摄取进入胞内。在术后28天,WB结果显示相比于Sham组小鼠,MI+PBS组小鼠Bax、cleaved caspase-3等促凋亡蛋白的表达水平显著上调,Bcl-2等抗凋亡蛋白的表达水平显著下调,而相比于MI+PBS组小鼠,MI+Exo组小鼠Bax、cleaved caspase-3等促凋亡蛋白的表达水平显著下调和Bcl-2等抗凋亡蛋白的表达水平显著上调;相比于Sham组小鼠,MI+PBS组小鼠PI3K和AKT等蛋白的磷酸化表达水平显著下调,而相比于MI+PBS组小鼠,MI+Exo组小鼠PI3K和AKT等蛋白的磷酸化表达水平显著上调。结论:人脐静脉内皮细胞来源外泌体改善心肌梗死后纤维化,促进心功能恢复,而这种心肌保护效应可能是通过激活PI3K/AKT信号通路抑制心肌细胞凋亡所介导的。