转Bt基因抗虫棉是我国棉花害虫综合防治的重要手段之一,转Bt基因棉花种植面积的快速增长,使其主要靶标昆虫棉铃虫Helicoverpa armigera存在产生抗性的风险。一旦棉铃虫对Bt转基因棉花产生抗性,会威胁各种Bt制剂、转Bt基因棉花和其他Bt作物的使用寿命。棉铃虫Bt抗性机理的研究是抗性监测、风险预测和抗性治理的基础,对于合理、有效使用Bt,延长转Bt基因棉使用寿命有重要的意义。氨肽酶N(Aminopeptidase N)已被确认为多种昆虫中肠Bt毒蛋白在的主要受体,但APN与昆虫Bt抗性产生的关系还存在很多争议,重组棉铃虫APN蛋白对其功能进行研究对棉铃虫Bt抗性机制的研究有重要意义。本研究利用本实验室筛选的棉铃虫Bt试剂敏感品系96S和抗性品系品系BtR,分别克隆幼虫中肠氨肽酶N1(APN1)基因的去信号肽片断,比较预测氨基酸序列得知:APN1/BtR有1个氨基酸缺失,即45苏氨酸缺失,5个氨基酸发生突变,即194苏氨酸→丝氨酸,550缬氨酸→异亮氨酸,861异亮氨酸→苏氨酸,902丙氨酸→脯氨酸,954苏氨酸→脯氨酸。本研究采取了Bac to Bac表达系统,分别对APN1/96S和APN1/BtR重组表达,该系统具有高效表达,翻译后修饰,无内毒素污染等优势。将APN1克隆至杆状病毒转移载体pFastBacHTb,将重组质粒pFastBacHTb-APN1转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,发生体内重组,获得杆粒Bacmid-APN1。杆粒DNA在脂质体Lipofectin介导下侵染粉纹夜蛾Trichoplusia ni细胞(Tn-5B1-4),获得含APN1基因的重组杆状病毒,重组病毒感染Tn细胞后,表达目的蛋白。SDS-PAGE分析和Ligand blot配体杂交显示,目的蛋白成功表达,重组蛋白APN1/96S和APN1/BtR在变性条件下均能与Cry1Ac毒素结合。测定病毒滴度,以MOI=3.0大量感染并收获细胞,由于重组蛋白带有His-tag标记,细胞破碎后,采用HisTrap Ni离子亲和层析柱纯化重组蛋白,Ni离子亲和层析柱吸附His-tag标记蛋白,以高浓度咪唑洗脱结合蛋白。SDS-PAGE分析和Ligandblot配体杂交显示,成功纯化重组蛋白。本研究通过比较棉铃虫敏感、抗性品系幼虫中肠前部和后部BBMV中APN活力,验证APN的活力是否与昆虫Bt抗性相关。结果表明APN活力在中肠前部和后部的分布符合APN作为Bt毒素受体的功能,但敏感、抗性的幼虫之间中肠各部的APN活力没有显著差异。为APN活力与昆虫Bt抗性,APN在昆虫Bt抗性中的作用的研究提供实验依据。